《武汉工程大学学报》  2010年12期 39-42   出版日期：2010-12-31   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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昆虫抗菌肽的诱导及其对荷瘤裸鼠抗瘤作用研究


抗菌肽是生物体内由特定基因编码产生的一类小分子多肽,具有抗细菌、真菌、寄生虫、病毒,杀害肿瘤细胞的功能,不产生耐药性,对正常人体细胞无伤害,是新型抗菌药物的理想选择［1］.抗菌肽最初的研究集中于其抗菌活性,但是近年来不断有抗菌肽抑癌作用的报道,主要集中于体外即细胞学研究,其抗瘤谱包括宫颈癌、髓样白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、成神经细胞瘤,纤维肉瘤、鼠的嗜铬细胞瘤等［211］.而且,在相同剂量下,抗菌肽只能杀死肿瘤细胞,对正常细胞无毒副作用.为了进一步研究抗菌肽对肿瘤细胞的作用,本研究通过脂多糖诱导草地贪夜蛾卵细胞系SF-9产生抗菌肽,并且首次将其通过体内实验作用于人宫颈癌细胞SiHa,观察其抗瘤效果,为下一步临床试验做准备.1实验部分1.1细胞株人宫颈癌细胞SiHa,由武汉大学提供.在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,37 ℃,5%CO2,饱和湿度培养.草地贪夜蛾卵细胞系SF9,由武汉大学提供.在含10％胎牛血清的Grace培养液常规培养,以备诱导.1.2实验动物Balb/c裸小鼠30只,鼠龄4～6周,实验分组时体重（21.12 ±1.03） g,均为雌性.均购自中国上海SLAC实验动物中心,SPF(无特定病原体)环境中饲养.1.3抗菌肽的诱导和提取
1.3.1抗菌肽的诱导将LPS（Sigma 公司产品）加入处于对数生长的SF9细胞,LPS 终浓度为1 μg/mL,28 ℃恒温培养.分别收集诱导后2、4、8、12、16、20、24、36、48 h培养物上清液,并观察培养细胞形态及生长增殖情况.设未加LPS对照组培养细胞.
1.3.2抗菌肽的提取将收集的培养上清500 r/min 离心5 min,上清经0.22 μm过滤器过滤,加入三氯醋酸（最终质量分数10％）冰浴10 min,8 000 r/min 离心10 min,取沉淀蛋白,用91的丙酮和水洗涤,14 000 r/min离心15 min,沉淀物真空干燥备用.1.4抗菌活性物质的活性检测a. 实验菌株大肠杆菌抗氨苄菌株K12D31由本室保存.b. 比浊法 对SF-9细胞按照LPS终浓度为1 μg/mL诱导,并在诱导后2、4、8、12、16、20、24、36、48 h收集培养上清液,将提取的细胞上清沸水浴10 min,10 000 r/min离心10 min,上清以0.45 μm滤膜抽滤,取0.8 mL滤液于enpendof管中,加入对数生长期的大肠杆菌抗氨苄菌株K12D31 20 μL,加氨苄青霉素至终浓度50 μg/mL,150 r/min,37 ℃恒温培养3～4 h至细菌生长至对数生长期,取出冰浴10 min,用核酸蛋白仪测定OD600值.将所测结果带入公式U=(A0/A-1)-2,求得抗菌肽的活力单位.以时间为横坐标,活力单位为纵坐标,绘制时间与活性关系曲线.c. 抑菌圈法 灭菌双蒸水溶解提取的抗菌肽沉淀（10 μL/mg）,滤纸片直径5 mm,每张纸片吸取5 μL样品, 所用菌种为大肠杆菌抗氨苄菌株K12D31,作好的平板在培养箱中于37 ℃培养24 h,观察抑菌圈直径大小.1.5诱导动力学的测定对SF9细胞按照LPS终浓度为1 μg/mL诱导,并在诱导后2、4、8、12、16、20、24、36、48 h收集培养上清液,提取抗菌物质用液体培养抑制测定法测定抑菌活性.以时间为横坐标,活力单位为纵坐标,绘制时间与活性关系曲线.1.6抗菌肽对SiHa细胞的体外杀伤作用将生长状况良好的SiHa细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,用完全RPMI1640 培养液稀释细胞为5×105个/毫升,以每孔150 μL接种于96 孔培养板上,置37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度的培养箱中培养,于细胞培养的第2 d 将抗菌肽用1 640培养液分别配制成10、1.0、0.1、0.01、0.001 μg/μL,各取25 μL分别加入癌细胞实验组孔中,每组设6个复孔,另设培养液空白组和5FU阳性对照组,继续置37 ℃、5 %CO2及饱和湿度的培养箱中培养,分别于培养24 h和48 h 每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL) ,继续培养4 h ,吸净上清,每孔加入150 μL DMSO,在振荡器上避光振荡10 min 使结晶完全溶解,于酶标仪570 nm处测定各孔OD值,并按下列公式计算细胞杀伤率.细胞杀伤率(％)=(1-a/b)×100％
其中：a,对照组的光密度值;b,实验组的光密度值.第12期包永芬,等:昆虫抗菌肽的诱导及其对荷瘤裸鼠抗瘤作用研究
武汉工程大学学报第32卷
1.7荷瘤裸鼠模型的建立将处于对数生长期的人宫颈癌细胞SiHa用胰酶消化后,用PBS重悬,调整细胞密度为2×107个/毫升,取0.2 mL注入到裸鼠左后肢背部皮下［11］.每2~3 d 观察一次动物,用手触摸及卡尺测量确定肿瘤,以肿瘤平均直径来衡量瘤体大小,肿瘤平均直径＞3 mm为肿瘤呈阳性的标准; 然后随机分组,组间体重差别不超过±1 g.次日开始肿瘤局部给药,连续4天,每次注射剂量为:实验组注射上述制备的抗菌肽0.2 mL/20 g小鼠(24 mg/kg).阳性对照组注射5一氟脲嘧啶20 mg/kg,阴性对照组注射PBS 1毫升/次.第10 d颈椎脱臼处死小鼠,分离出肿瘤组织并称重,比较实验组和对照组的瘤重差异,按下列公式计算肿瘤的抑制率.并且肿瘤组织做常规病理切片观察.抑制率(％)=(对照组的平均瘤重一实验组的平均瘤重)÷对照组的平均瘤重2结果与分析2.1抗菌活性物质产生的动力学在诱导后2、4、8、12、16、20、24、36、48 h收集培养上清液,提取抗菌物质用液体培养抑制测定法测定抑菌活性.结果如图1所示,诱导后4 h开始产生抗菌物质,16 h后达到最高峰,16~20 h活力基本保持不变,再延长时间,活力明显下降.图1诱导时间与细胞产生的抗菌活性物质的活力关系
Fig.1The relation between the time of induce and the activity of antibacterial peptide2.2不同诱导时间抗菌肽产生的抗菌活性用大肠杆菌抗氨苄菌株K12D31作为指示菌来测定LPS诱导SF9细胞产生的抗菌肽抑菌活性时,可观察到明显的抑菌圈(图2).图2SF9细胞经LPS诱导后诱导产物的抗菌活性检测
Fig.2The inhibitory activity of antibacterial substance from inducing SF9 by LPS
注：a为SF9经LPS诱导样品;b为SF9细胞对照样品;c为无菌水.2.3抗菌肽对SiHa细胞的体外杀伤作用采用MTT 法检测了不同浓度抗菌肽对SiHa细胞不同时间的杀伤效率,结果见表1 .由表1可知,抗菌肽对癌细胞均具有一定的杀伤作用,随着药物浓度增加,作用时间延长,细胞增殖速度减慢,当抗菌肽浓度升为0.10 μg/μL时其杀伤效应明显增强,并呈剂量-效应关系和时间-效应关系,具有浓度依赖性和时间依赖性.表1抗菌肽对体外培养癌细胞杀伤作用(±s,%)
Table 1the killing action of antibacterial peptide s on cancer cells cultured in vitro
时间/h质量浓度/（μg/μL）0.0010.010.111024h2.62 ±0.8813.23 ±0.9259.10 ±1.2862.84 ±0.6575.80 ±0.7848h3.12 ±0.3414.75 ±0.7463.22 ±0.7372.45 ±0.8886.8 ±1.302.4昆虫抗菌肽对裸鼠移植瘤的治疗效果局部组和5FU抑瘤率分别为80.00%和81.25%.瘤重比较抗菌肽实验组加上5FU组和阴性对照组比较均有显著差异(P<0.01),局部组和5FU比较无明显差异(P>0.05,见表2).表2治疗组对荷宫颈癌SiHa小鼠的
第10天抑瘤作用(n=10)
Table 2Antitumor activity of insectival antibacterial peptides in nude mice bearing human cervical cancer cell line SiHa
组别数量瘤重（g）抑瘤率（%）阴性对照组100.80 ±0.155FU阳性对照组100.15 ±0.0581.25抗菌肽局部组100.16 ±0.0680.005-FU 处理组瘤组织内出现大片状出血坏死灶,少量淋巴细胞浸润.抗菌肽局部处理组癌瘤大面积出血坏死,坏死区内及残存癌细胞周围较多炎细胞呈包围状,可见到单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞,以淋巴细胞为主(见图3、4).图3阴性对照组H&E染色结果
Fig.3The negative control group, H & E staining图4抗菌肽局部治疗组H&E染色结果(×400)
Fig.4The local treatment group peptide H & E staining(×400)3结语Samakovlis等［12］用LPS、昆布多糖诱导黑毛果蝇的传代血细胞系产生天蚕肽（cecropin）,说明LPS 等是昆虫培养细胞产生抗菌肽很好的诱导源.本实验用LPS 诱导离体培养的家蝇胚胎细胞产生了活性较高的抗菌物质,并且在诱导后16 h 达高峰.本研究结果表明,抗菌肽对人宫颈癌细胞SiHa生长有显著的抑制作用,且随着抗菌肽浓度增加,作用时间延长,细胞增殖速度减慢,呈剂量-效应关系和时间-效应关系.体内试验结果表明,昆虫抗菌肽对荷人宫颈癌细胞SiHa裸鼠具有较明显的抑制肿瘤作用.显微镜下观察各治疗组的肿瘤组织,发现局部注射昆虫抗菌肽时,癌细胞周围较多炎细胞呈包围状,以淋巴细胞为主,并可见到单核细胞和中性粒细胞浸润,而腹腔注射昆虫抗菌肽、腹腔注射5FU都没有类似的效果.作为完全抗原的物质,其分子量一般需在10 kD以上,分子量在5 kD以下的肽类一般无抗原性,不足以引起机体的免疫排斥反应.昆虫抗菌肽由33～39个氨基酸残基组成,分子量4 kD～5 kD,可以基本排除外源性抗原引起的免疫反应.试验结果提示昆虫抗菌肽可能对裸鼠的免疫功能有较好的促进作用,而不象5-FU这类化疗药物对机体的免疫功能起着抑制作用.近年来国内外许多学者研究了抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用,结果表明,抗菌肽抑杀肿瘤细胞机制与杀菌机制不尽相同,它比杀菌机制更为复杂.一方面,它直接接触性抑杀肿瘤细胞,主要从细胞膜、线粒体、核膜、细胞核染色体和细胞骨架等方面来达到抑杀肿瘤细胞的效果;另一方面,抗菌肽还可以通过调动机体免疫机能,从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵.有关抗菌肽作用于Siha细胞的机理有待于以后进一步深人研究.