《武汉工程大学学报》 2012年9期
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出版日期：2012-10-10
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
不同基因缺失型酵母对全氟辛酸的灵敏性
0引言全氟辛酸（PFOA）是一种全氟有机酸，是聚四氟乙烯化工产品的关键原材料，以及许多全氟化合物的重要前体，也是一类重要的全氟表面活性剂.其分子式为C8F15O2H，相对分子质量为414，熔点4550 ℃，沸点189192 ℃/9.812 kPa，水溶性为3.4 g/L\[1\].全氟化合物由于其疏水疏油和稳定的化学性质\[2\]被广泛使用，其中包括：石油化工、涂料、农药、纺织类、皮革品、家具、地毯、泡沫灭火剂等，还有与人们生活密切相关的纸张、食品包装、不粘锅涂层等\[3\].从20世纪80年代开始，由于全氟有机化合物在工业及民用领域的应用迅速增长，PFOA及其盐类产品大量使用，导致全球范围的各种环境介质如土壤、底泥、水体、大气中，通过食物链放大作用而存在于许多动物和人体中\[4\]. PFOA具有疏水疏油的特点，不易降解而容易在生物体内蓄积，在生物体内大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余蓄积在动物的肝脏和肌肉组织中，引起其各个脏器不同程度的毒性损伤\[5\].毒理学研究证明PFOA是啮齿动物的致癌剂\[6-10\]，具有肝脏毒性、心血管毒性、生殖毒性和胚胎发育毒性、遗传毒性、免疫系统毒性、甲状腺毒性和致癌性\[11\].酵母是最简单的高等真核生物，是真核生物研究的模式生物.酵母在三个不同水平上调节遗传毒性化学物在细胞内的累积：细胞壁、细胞膜的通透性以及细胞的多药抗性机制（PDR途径）\[12\].CWP1，CWP2基因编码细胞壁苷露糖蛋白，失活可明显提高酵母细胞壁通透性；SNQ1，SNQ2基因编码外排泵蛋白，失活可明显提高酵母内检测系统对不同分子量化学物的灵敏度；YAP1基因调控许多关键抗氧化基因的表达，失活可明显提高酵母检测系统检测DNA氧化损伤剂的能力\[13\].由于全氟化合物的广泛使用和全球的普遍污染，越来越多的学者开始研究其在环境中的污染现状、致毒机理和对人体的健康威胁.采用基于细胞培养的离体生物方法评估环境污染物的毒理学效应，相比于鱼类、白鼠等活体动物实验，具有成本低、时间短、灵敏度高等优点，因此具有广阔的应用前景.酵母细胞属于单细胞生物，除了缺乏哺乳动物细胞复杂的受体系统外\[14\]，还具有易培养、生长快、价格低等优点.本研究旨在筛选基因缺失型酵母来检测环境中的有毒污染物，以PFOA为污染物模型，探究其对不同缺失型酵母的毒性机理.1实验部分1.1实验试剂本实验PFOA为纯度大于97％的固体，购买自Merck公司，标准储备液为1.0 mol/L，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）、SDUra培养液.SDUra培养液：酵母氮源无氨基无硫酸铵0.17%、硫酸铵 0.5%、腺嘌呤 0.2%、色氨酸 1%、组氨酸1%、亮氨酸1%、赖氨酸1%（以上百分数均为质量分数）.固体培养基加质量分数2%的琼脂粉，溶于蒸馏水中高压灭菌后，加入质量分数40%的葡萄糖致最终质量分数为2%.1.2实验器材高压灭菌锅（LDZX30KBS），上海申安医疗器械厂生产.摇床（THZC），江苏太仓实验设备厂生产.恒温培养箱，上海一恒科技有限公司生产.超净工作台（Ai Tech），苏州安泰空气技术有限公司生产.移液枪（eppendorf）、90 mm培养皿、试管、三角瓶.1.3实验生物本研究野生型酵母细胞BY4741和其4基因缺失型突变体（cwp1△cwp2△snq1△snq2△）、5基因缺失型突变体（cwp1△cwp2△snq1△snq2△yap1△）菌株均来自于中科院水生生物究所水生动物蛋白质工程学科组.1.4实验方法实验前均将配制的SDUra培养液在高压灭菌锅中灭菌，把三种酵母（BY4741、4基因缺失型突变体、5基因缺失型突变体）接种到SDUra液体培养基中，30 ℃，200 r/min摇床过夜培养16 h.第二天用SDUra液体培养基将培养的酵母培养液稀释，分光光度计检测其OD值为0.11，继续30 ℃，200 r/min摇床培养2 h，测其OD值为0.14时开始染毒.染毒后的酵母培养液继续30 ℃，200 r/min摇床培养4 h.取出酵母细胞培养液在超净工作台用无菌水稀释105倍后，取100 uL涂SDUra固体培养基平板，30 ℃培养箱中培养两天，对长出的单克隆子进行统计计数.第9期金士威，等：不同基因缺失型酵母对全氟辛酸的灵敏性
武汉工程大学学报第34卷
2结果与分析2.1DMSO溶剂对酵母生长的影响生物实验常以DMSO为污染物的载体溶剂，本实验探索了不同的DMSO浓度对酵母生长的影响.由实验结果得知，当DMSO在培养液中的质量分数小于0.5%时，对3类酵母细胞的生长没有明显影响；而当DMSO质量分数为5%时，则产生明显的影响，特别是对5基因缺失型酵母突变体，影响更为显著，其存活率降为70%.故以后的实验中，培养液中DMSO的浓度不超过0.5%，以避免溶剂的影响.2.2染毒后酵母的培养时间与细胞生长量的关系为了验证酵母细胞染毒后细胞生长量与培养时间的最佳关系，酵母细胞培养液在染毒后分别在30 ℃，200 r/min摇床分别培养0、2、4、6、8 h，随后分别在超净工作台用无菌水稀释105倍，分别取100 uL涂SDura固体培养基平板后，在30 ℃培养箱中培养两天后，对生长出的单克隆子计数，其结果如图1所示.染毒超过4 h后，酵母增殖上处于不增殖的状态，所以本实验酵母细胞培养液染毒后继续培养的时间定为4 h.图1酵母培养时间与酵母生长量的关系
Fig.1Effect of culture time on the growth of yeast2.3PFOA浓度对酵母生长的影响酵母细胞培养液加PFOA后，30 ℃，200 r/min摇床继续培养4 h，在超净工作台用无菌水稀释105倍后涂SDUra固体培养基平板，30 ℃培养箱培养2 d后，对生长出的单克隆子计数，其结果如图2.由图2知，当PFOA浓度为0.6 mmol/L时，野生型酵母、4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体存活率分别为77.4%、69.7%和50.5%；当PFOA 浓度为1.2 mmol/L时，野生型酵母、4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体存活率分别为35.4%、15.2%、8.0%，4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体的存活率下降比较快；而当PFOA浓度大于1.2 mmol/L时，野生型、4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体存活率都为零（图中未显示）.与野生型酵母相比，PFOA对4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体生长影响比较明显，而对5基因缺失型酵母突变体生长影响尤其明显.图2PFOA对酵母毒性实验（n=4）
Fig.2Effect of the concentration of PFOA
on the growth of yeast由以上实验结果可知，PFOA对4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体的影响比野生型酵母细胞灵敏，可能因为4基因缺失型酵母突变体和5基因缺失型酵母突变体都缺失了编码细胞壁苷露糖和细胞外排泵蛋白的基因，从而对外界毒物抗性的抵御机制减少很多，能很灵敏的感受到外界环境的压力；而5基因缺失型酵母突变体比4基因缺失型酵母突变体又少了能调控许多关键抗氧化基因的表达的YAP1基因\[12\]，缺失了YAP1基因的5基因缺失型酵母突变体比4基因缺失型突变体对PFOA的灵敏性更强，说明5基因缺失型酵母突变体受到外界环境压力的时候不能有效的防御细胞的氧化损伤.综上，当缺失了编码细胞壁苷露糖和细胞外排泵蛋白的基因的酵母受到外界环境的压力或者毒物的胁迫时，毒物可能以分子的形式从细胞壁进入细胞\[15\]，损害细胞的正常生理功能，进而致使酵母产生氧化损伤\[13\].由于PFOA等全氟化合物具有持久性和生物累积性且又被广泛使用，其在全球范围无处不在，造成了较为严重的污染\[16-17\].Nobuyoshi\[18\]等研究表明全球各个大洋海域、日本、韩国、中国大陆沿海海域中均有有机氟化合物的存在，其中PFOA的含量均处于较高的水平.Kannan等\[19\]检测到地中海、波罗的海海豚肝脏中的PFOA高达878 ng/g.人群调查结果显示，一般人群体内有一定水平的PFOA暴露，有的可以达到很高的水平.Ehresman\[20\]等测量了美国3M公司18位职业工人血清中PFOA浓度为1 046 ug/L，日本居室灰尘中被检测出PFOA质量浓度范围为112 500 ng/g\[21\].我国是有机氟化合物生产和消费大国，但对全氟化合物对人类健康和环境的威胁的研究还处于初级阶段，极有必要开展进一步的研究.酵母作为真核生物的模式生物，可以替代活体动物模型，利用其不同基因缺失型酵母突变体研究环境污染物的毒理学效应，如氧化损伤及氧化损伤修复机理、以及后续要研究的核苷酸切除修复和碱基切除修复等，在此筛选的基础上，可以选择对外界污染物较敏感的5基因缺失型酵母突变体为暴露模型，以建立酵母菌株检测和评估环境污染物毒性效应的平台.