《武汉工程大学学报》 2012年11期
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出版日期：2012-12-10
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
薄层层析分离鲟鱼胆汁
0引言我国鲟鱼商业化养殖始于20世纪90年代初期\[1\]，现已成为一种新兴的产业\[2\].鲟鱼素有“软黄金”、“活化石”之称，鲟鱼全身是宝，利用率极高.肉可制成小包装烤鱼片、炒鱼松、熏烤鱼等；鱼皮可制成高档皮革，也可制胶；鱼筋、鱼骨、鱼肚等都可做出独具风格的菜肴；鱼骨可制成高钙食品，对增强肌体免疫力、提高大脑活力、促进人体健康有极大益处；鱼鳍制作的鱼翅可以与鲨鱼翅媲美，具有“黑色黄金”之称的鱼卵可制成鱼籽酱；鱼油与内脏中含有大量的不饱和脂肪酸、叶酸，对于防止老年痴呆、软化心脑血管、治疗烧伤有重要的疗效\[3-4\].而鲟鱼胆却作为废弃物而丢弃，是一种资源的浪费.鲟鱼胆汁是一种墨绿色的粘稠液体，pH值为6~7\[5\]，含水质量分数为86.8%，醇溶物为87.5%.一直以来，国内外对鱼类胆汁的研究较少\[6\]，研究仅局限于对胆绿素、胆汁酸等成分的初步分析，对于鱼类胆汁的成分及其分离的研究还鲜见报道.鉴于对鱼类胆汁缺乏系统的科学研究，我国一直未对鱼胆汁作为药材在临床上使用\[7\].如能从鲟鱼胆汁中提取出其有效成分，则可充分利用废弃的鲟鱼胆汁资源，为制药行业提供必要的原料，缓解市场供需缺口的矛盾.为了综合利用鲟鱼加工下脚料，提高鲟鱼养殖业的附加值和中药产业临床应用的价值，急需开发一套有效分离鲟鱼胆汁有效成分的新工艺.本实验的目的是考察利用最佳的展开剂分离鲟鱼胆汁的可行性，为探索鲟鱼胆汁分离的新工艺和合理开发药用资源提供一定的参考基础及理论依据.1实验部分1.1原料、试剂及仪器 原料：鲟鱼胆汁, 湖北天峡鲟业有限公司提供;硅胶GF254,化学纯; 氯仿, 分析纯; 无水乙醇, 分析纯; 甲醇, 分析纯; 石油醚, 分析纯; 乙酸乙酯, 分析纯; 乙醚, 分析纯; 丙酮, 分析纯;甲苯, 分析纯; 硫酸, 分析纯；羧甲基纤维素钠, 粘度800~1 200 mPa·s. 仪器：AL204电子分析天平, 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司生产; DHG9070A型电热恒温鼓风干燥箱, 上海精宏实验设备有限公司生产; KA1000型低速台式离心机, 上海安亭科学仪器厂生产.1.2鲟鱼胆汁样品液的制备称取鲟鱼胆汁多糖2.0 g，使其溶于20 mL甲醇中，充分搅拌有部分不溶物，将此溶液转移至离心管中，3 000 r/min离心0.5 h，分离出黄绿色的上层清液备用.1.3硅胶板的制备将75 mm×26 mm的载玻片依次用水和乙醇洗净并晾干.称取2.5 g CMCNa于1 L烧杯中，加入500 mL蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌均匀，并在电炉上加热至沸，使CMCNa充分溶解，冷却，配置成质量分数0.5％CMCNa水溶液备用.称取25.0 g硅胶GF254，与70 mL CMCNa水溶液混合，在烧杯中调成糊状，充分搅拌至无气泡.用药匙量取一定量调制好的硅胶涂匀于载玻片上，将载玻片在桌面轻震使其表面平坦光滑，薄层厚度控制在0.25 mm左右，将制备好的硅胶板在室温条件下自然干燥，然后转移至110 ℃的烘箱中加热活化0.5 h，自然冷却后放入干燥器中备用\[8\]. 1.4显色剂的选择本实验选用的显色剂为质量分数20%的硫酸乙醇.称取80 g无水乙醇和20 g浓硫酸，将两者混合均匀，放入试剂瓶中备用.1.5点样、展开与显色用管口平整、内径为0.5 mm的毛细管吸取样品液，并将吸取样品的一侧轻轻接触距离硅胶板下端约10 mm处点板并重复多次点样，观察样点为黄绿色.若同一块薄层上需点多个样点时，样点之间距为10 mm左右，而且要保证样点在同一水平线上.点样后，待溶剂完全挥发再将硅胶板放入层析缸中，当展开剂前沿到距离硅胶板上端10 mm左右时取出，将硅胶板用电吹风吹干，此时用质量分数20%硫酸乙醇溶液均匀喷洒于硅胶板上，置110 ℃烘箱中加热3~5 min，呈现出紫红色或紫色的胆汁酸斑点.选择展开剂的条件: a.对欲分离组分有良好的溶解性； b.可使各组分分开，待测组分的定量测定在0.3左右，Rf值在0.2~0.8之间； c.不能与吸附剂或待测组分发生化学反应，沸点适中，黏度要小，展开后各组分斑点集中\[9\].第11期陈金芳，等：薄层层析分离鲟鱼胆汁
武汉工程大学学报第34卷
2结果与讨论 2.1单元溶剂系统根据溶剂对胆汁的溶解性，选用8种较常用的溶剂为展开剂，显色后图谱如图1.由图1可知，氯仿（A）虽可分离出一种组分，但对于其中两种组分的极性偏小；甲苯（B）可分离出其中的两种组分；石油醚（C）可以分离极性较大的组分，但对于极性小的组分分离效果不明显；甲醇(D)和乙酸乙酯（H）极性较大，可将胆汁中极性较小的组分展开至前沿位置；无水乙醇（E）、丙酮（G）均有不同程度的拖尾现象，不能分离胆汁中组分；乙醚（F）的极性最小，所有组分在原点未移动；水（I）将所有组分推至溶剂前沿.无水乙醇（E）和水（I）的展开时间太长，约1 h，其它溶剂的展开时长约10 min.图1单元溶剂系统的TLC图谱
Fig.1TLC spectrum of unit solvent system
注： 展开距离（点样线到溶剂前沿的间距）
均为56 mm；用虚线显示拖尾；A-I表示展开剂.
A．氯仿；B.甲苯；C. 石油醚；D.甲醇；E.无水乙醇；
F．乙醚；G.丙酮；H.乙酸乙酯；I.水.2.2二元溶剂系统单一溶剂不能很好地展开胆汁中各组分，则选用混合溶剂作为展开剂.首先用一种极性较小的溶剂作为基础展开溶剂混合物，观察展开效果，若不好再用极性较大的溶剂与前一种溶剂相混合，并不断调整混合溶剂的配比，直至选出合适的展开剂组合.乙醚是易挥发、低沸点的溶剂，溶剂损失较大，故不选乙醚与其它溶剂混合.参照图1的显示结果，将极性较大和较小的溶剂相组合作为展开剂，显色后如图2.图2二元溶剂系统TLC图谱
Fig.2TLC spectrum of binary solvent system
注： A-H表示展开剂.A.氯仿/甲醇（5∶1，体积比，下同）;B. 氯仿/甲醇（10∶1）;C. 氯仿/乙醇（10∶1）;D.氯仿/乙醇（15∶1）;E. 甲醇/乙酸乙酯（2∶1）;F. 乙醇/乙酸乙酯（2∶1）;G. 石油醚/丙酮（3∶1）;H. 石油醚/乙酸乙酯（5∶1）.由图2的显示结果可知，展开剂A、B分离效果较佳；溶剂C、D、E、H均有不同程度的拖尾现象；溶剂F的极性最大，不能分离出胆汁中的组分.展开时间约10 min.2.3三元溶剂系统由图3可知，三元溶剂A、C可以分离出胆汁中的三种成分，但与二元溶剂相比，三元溶剂不易回收；溶剂D、E、F的极性略大，显色后位于板上部有一斑点，这表明胆汁中某种组分已被展开至板顶；溶剂G虽可观察到4个主斑点，但各组分之间均有拖尾现象.图3三元溶剂系统TLC图谱
Fig.3TLC spectrum of multiple solvent system
注： A-G表示展开剂.A．氯仿/甲醇/甲苯（5∶1∶1，体积比，下同）;B.氯仿/甲醇/甲苯/石油醚（5∶1∶1∶1）;C.石油醚/丙酮/甲苯（3∶1∶1）;D.石油醚/丙酮/乙醇（3∶1∶1）;E.石油醚/甲醇/甲苯（1∶1∶1）;F．氯仿/甲醇/甲苯（10∶2∶1）;G．氯仿/甲醇/乙醇（5∶1∶1）.3结语实验中选用不同的溶剂系统作展开剂，对鲟鱼胆汁中的有效成分进行薄层层析分离.应用硅胶薄层层析法分离鲟鱼胆汁，筛选和优化展开剂，作为柱层析的洗脱剂体系分离鲟鱼胆汁的重要参考依据.溶剂的选择和配比对鲟鱼胆汁的分离效果均有显著的影响.如何进一步提高胆汁中各组分的分离效果将是后续工作的重点.整个分离过程投资少，节约能源，对后续的柱层析分离有重要的参考价值.致谢：感谢湖北天峡鲟业有限公司提供的鲟鱼胆汁等实验材料.