《武汉工程大学学报》 2014年08期
10-15
出版日期：2014-08-31
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
γ-氨基丁酸受体同源模建及与黄酮类化合物的分子对接
0引言 黄酮类化合物(如图1)具有突出的抗焦虑效果，且不引起肌肉松弛、健忘等副作用.这些重大发现推动了对选择抗焦虑，亲和力高的配体研究.6溴黄酮相对于黄酮对GABAA受体的苯二氮唑结合位点的亲和力增加了近10倍［1］.6溴黄酮和GABAA的竞争结合参数是1.6～2.0（通过加入或不加入GABA时测量而得的6溴黄酮和苯二氮唑结合位点的作用值比），与地西泮很类似，具有完全激动剂的药理学特征［2］.当引入硝基时甚至会得到更有效的配体，6，3’ 二硝基黄酮与苯二氮唑位点结合力更强，其Ki值取值范围为17～50 nmol/L，它具有极有效的抗焦虑和肌肉松弛作用.6溴3’硝基黄酮相对于双硝基类似物，对GABAA受体苯二氮唑结合位点的亲和力稍有增加，对苯二氮唑位点同样具有选择性［3］.这类化合物的抗焦虑作用尽管比6，3’二硝基黄酮稍差，但仍比地西泮的抗焦虑作用强.由于黄酮类化合物药理学选择性及其自身对GABAA受体苯二氮唑结合位点的活性低，使得对其衍生物的研究有了一个很大的飞跃，同时也对GABAA受体苯二氮唑结合位点选择性有了新的认识，促进了黄酮类化合物的发展.本研究采用海兔乙酰胆碱结合蛋白（2XYS）作为模板，对人α1β2γ2 GABAA受体进行模建并能量优化，利用分子对接进一步指导研究.此外，从对接结果进行分析，发现黄酮类化合物的3’位对活性影响很大，且增多取代基团也会提高活性，进而为更好的设计黄酮类化合物提供了理论依据. 图1黄酮类化合物的基本结构Fig.1Structure of flavonoid1实验部分本研究的所有计算实验都是通过SYBYLX1.2软件（Tripos Inc.）完成，若无特别介绍，参数均采用缺省值.1.1人α1β2γ2GABAA受体同源模建1.1.1同源模建简介大多数受体蛋白的三级结构尚未解析，并且同源蛋白在进化过程中保持着结构保守性，利用同源蛋白作为模板来构建受体蛋白是一种有效的方法［4］.常用的软件有两类：一是利用蛋白质分析软件来预测，例如SWISSMODEL主要用于预测蛋白质的高级结构，它通过同源建模的方法可对未知序列的三级结构进行预测；另一类是对蛋白的结晶进行X衍射、核磁共振技术及冷冻电镜等方法获得结构信息，将已知的蛋白质立体结构为模板，利用相关软件构建已知序列的蛋白高级结构，例如SYBYL, Discovery Studio，Modeller都是比较常用的软件 .1.1.2同源模建a.序列选择 为了模建目标受体人α1β2γ2GABAA受体，首先通过SwissProt/TrEMBL数据库筛选出合适的亚基序列：人α1亚基（蛋白质序列号：P14867），β2亚基（蛋白质序列号：P47870），γ2亚基 (蛋白质序列号：P18507)，然后对以上3种亚基进行编辑.考虑到所构建的受体在跨膜区，所以删去膜内环区与膜外结合区域的氨基酸序列. b.模板选择 模板在同源模建中起关键作用，它直接影响靶结构的质量，并对结果起决定性作用［5］.由于膜介蛋白晶体结构较难获得，且当前结构解析技术直接决定了膜介蛋白结构的分辨率，因此已解析的三维结构膜蛋白数目十分有限.本实验中，采用海兔乙酰胆碱结合蛋白作为模板（PDB登记号2XYS，0.194 nm）［6］.第8期巨修练,等：γ-氨基丁酸受体同源模建及与黄酮类化合物的分子对接武汉工程大学学报第36卷 c.构建亚基 首先采用SYBYLX1.2中的Biopolymer模块中的compare sequences将靶标序列与模板序列进行比对(sequence alignment)，从而生成MSF (multiple sequence format)文件［7］.然后再将Model Proteins中的ORCHESTRAR模块中导入MSF文件，将模板结构与靶序列的三维结构进行结构比对.最后构建靶肽链的结构，包括搜索环区，识别结构保守区域(structure conserved regions，SCR)和添加侧链. d.模型组合 将人α1β2γ2受体与模板2XYS进行比对，需要将前者的α1亚基β2亚基γ2亚基分别叠合到2XYS为模板的各个亚基上,以顺时针方向(β2)(γ2)(α1)(β2)(γ2)构建人α1β2γ2GABAA受体，如图2所示. 图2人α1β2γ2 GABAA亚基对应示意图Fig.2Subunit of human α1β2γ2 GABAA e.模型的优化与修正 因为只有运用分子动力学与分子力学的方法对受体进行修正，才能验证受体的可靠性.因此，本实验选取立体场AMBER7 FF99［8］，运用共轭梯度法优化体系能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm，并通过分子动力学（molecular dynamic, MD）优化模型，以检验模型的稳定性.计算条件设置为300 K恒温，每2.5 ps采样一次轨迹数据，步长1 fs，计算总长为500 ps.1.2分子对接1.2.1对接方法本实验首先利用分子对接法将前面讨论的黄酮类配体化合物与人α1β2γ2 GABAA受体蛋白对接.并结合打分函数，研究配体化合物与受体蛋白之间的相互作用，探究结合自由能与实测生物活性的线性关系，同时验证模型的可靠性.Surflexdocking［9］是SYBYLX1.2中的一个模块，可用于计算配体与受体之间的相互作用能，也可用于复合物的结构优化.本研究利用Surflexdocking进行分子对接实验. 因为受体的结合口袋直接影响分子对接结果，所以定义结合口袋具有十分重要的意义［10］.前文中同源模建人的α1β2γ2GABAA亚型，选用共晶的6氟3’硝基黄酮作为活性区域，利用残基模式定义活性结合位点. Surflexdocking模块中，原型分子（protomol）即我们所称的活性位点.此外，bloat与threshold这两个参数直接影响原型分子的大小与形状. 其中，Bloat影响原型分子渗入蛋白空隙的程度，Threshold影响原型分子的大小［11］.1.2.2对接配体分子通过SYBYLX1.2软件中的dock ligand模块，41种黄酮类化合物（如图7）对接到模建的α1β2γ2GABAA受体中.Surflexdocking进行对接实验后，分子配体的对接结果可通过Csorce模块显示.打分函数基于受体配体复合物的结合亲和力，将会考虑熵作用，极性作用，疏水作用，排斥作用，溶剂化作用.最后给出的总分即lg10Kd，Kd为配体的解离常数.可通过以下函数计算配体与受体的结合自由能（Free Energy of Binding, kcal/mol）: Free Energy of Binding=RTlnK［1213］2结果和讨论2.1同源模建将海兔乙酰胆碱结合蛋白与α1β2γ2进行序列比对，得到其同源性（Identity）分别为19.3%，19.6%和16.0%，由此可知：选取的2XYS作为人α1β2γ2亚基模型是比较合理的.将人α1β2γ2 GABAA受体与海兔乙酰胆碱结合蛋白进行序列比对，如图3所示. 图3人α1β2γ2GABAA受体与海兔乙酰胆碱结合蛋白序列比对图Fig.3Result of sequence alignment between human α1β2γ2GABAA and aplysia californica nAChR 经过比对分子序列，搜索保守区域、构建疏水环区、添加分子侧链、分子动力学优化后，得到人α1β2γ2 GABAA的二级结构，如图4所示. 图4人α1β2γ2GABAA受体二级示意图Fig.4Secondary structure of human α1β2γ2GABAA人α1β2γ2GABAA受体需要进行结构修正和能量优化.通过ProTable验证受体模型的立体化学性质.人α1β2γ2GABAA的受体模型拉氏构象图如图5所示. 图5人α1β2γ2GABAA受体模型拉氏图 Fig.5Ramachandran graph of the human α1β2γ2GABAA receptor从以上拉氏图可知，大量的氨基酸残基聚集在值为150度与40度处，人α1β2γ2 GABA A受体模型中有96.76%的氨基酸残基处于允许区域，验证了模型的合理性.因此，实验中模建的人α1β2γ2 GABAA受体模型是可靠的，可用作分子对接实验.利用SYBYLX1.2的Dynamics模块进行分子动力学模拟，人α1β2γ2 GABA A受体模型的动力学模拟能量时间图如图6.经过分子动力学能量优化后，能量时间图里可知，α1β2γ2 GABA A受体模型在前300 ps能量变化较大，而后200 ps能量比较稳定，通过分子动力学实验，也说明了该模型是可靠的［1415］. 图6人α1β2γ2GABA A受体模型动力学模拟能量时间图Fig.6Potential energy with respect to simulation time for dynamicson the human α1β2γ2GABA A receptor 2.2分子对接本实验利用分子对接法将黄酮类化合物与人α1β2γ2 GABAA受体进行对接.通过上文软件打分函数评价对接结果.利用SYBYX1.2软件包中Surflexdocking模块进行分子对接以及氢键，通过分子对接和打分函数的方法对打分函数进行评价，得到黄酮类化合物与人α1β2γ2 GABAA受体的对接得分，如表1所示. 表1黄酮类化合物的对接得分Table 1Docking result of Flavonoids化合物结构编号R3R5R6R7R8R2’R3’R4’R5’R6’与人GABAA受体对接打分实测活性（lgKi）1HHBrHHHHHHH3.144 37.152HHCH3HHHHHHH2.682 86.903HHClHHHHHHH2.968 16.794HHNO2HHHHHHH3.535 56.565HHOHHHHHHHH2.868 26.246HHOCH3HHHHHHH2.570 66.077HHFHHHHHHH2.868 95.358HHHHHHHHHH2.921 46.009HHBrHHHNO2HHH3.374 09.0010HHCH3HHHNO2HHH3.598 48.2511HHClHHHNO2HHH3.407 68.1012HHNO2HHHNO2HHH2.793 97.5913HHFHHHNO2HHH3.886 56.7414HHHHHHNO2HHH3.523 66.5515HHBrHHHBrHHH3.036 77.7216HHCH3HHHBrHHH3.132 47.8917HHClHHHBrHHH2.763 27.6418HHNO2HHHBrHHH2.563 87.6019HHFHHHBrHHH2.644 56.6320HHHHHHBrHHH2.729 66.3821HHOHHHHBrHHH3.068 06.0022HHOCH3HHHBrHHH2.942 66.0023HHBrHHHClHHH3.351 77.7724HHClHHHClHHH2.382 67.6425HHFHHHClHHH3.211 36.7026HHHHHHClHHH2.729 26.2127HHBrHHHCH3HHH3.497 06.8128HHCH3HHHCH3HHH3.469 56.6829HHHHHHCH3HHH3.665 85.0030HHHHHHOCH3HHH3.511 35.6231HHHHHHFHHH2.994 15.4532HHBrHHHFHHH3.027 07.3833HHBrHHHOCH3HHH3.596 66.2234HHClHHHFHHH3.007 36.9335HHClHHHOCH3HHH3.029 36.0736HHFHHHFHHH3.104 96.0437HHFHHHOCH3HHH3.620 35.6038HOHOCH3OCH3OCH3OHHHOCH3H5.908 76.4439HHHOHHHHHHH3.954 65.2840HHHOHHHHOHHH4.217 24.1041〖7〗地西泮〖12〗3.390 98.15 由于13号分子打分较高，且结构相似性较高具有代表性，故对其与人α1β2γ2 GABAA受体对接图（图7），进行分析. 图7人α1β2γ2 GABAA受体与6氟3’硝基黄酮对接图Fig.7Human α1β2γ2 GABAA docking with 6fluoro3’nitro flavonoid从上图可知，13号分子3’位硝基的一个氧原子和氮原子作为氢键受体，与Arg97（精氨酸）侧链上的亚胺上的氢原子形成氢键，为配体分子与受体结合提供了条件，同时也验证了3’位对黄酮类化合物活性影响的重要性.而且从空间构象来看，13号分子的母环与Tyr190（酪氨酸）和Tyr140（酪氨酸）的苯环形成共轭，这样能使体系的能量降低，分子稳定，也说明了所建模型的合理性.同时，从表1中可以发现，对比1号分子与9号分子，2号分子与10号分子，3号分子与11号分子，7号分子与13号分子可发现，当6位所连基团相同时，将3’位的氢原子替换成硝基时，对接打分明显提高.同理可看出，将3’位替换为其他大分子基团时，对接打分也有所提高.且大部分化合物的对接打分与实测活性一致，也验证了模型的可靠性.综上所述，黄酮类化合物3’位对活性影响很重要.同时，38号化合物的高得分，可能与较多的取代基提高了与结合口袋的结合能力有关.3结语本研究通过同源模建人α1β2γ2 GABAA受体跨膜区的三维结构，并结合分子动力学优化和能量优化，验证了所建模型的稳定性与可靠性.进而将41个黄酮类衍生物与该模型进行分子对接实验，通过对接结果的分析，得知当母环3’位被取代时，分子活性有所增加，其中被硝基取代时，活性提高较大.并从38号化合物中得到提示，相应的增加取代基的个数，可能会提高活性，为设计黄酮类化合物提供了理论依据.致谢本实验基于武汉工程大学化工与制药学院提供的计算平台，在此表示感谢！