《武汉工程大学学报》  2015年06期 21-26   出版日期：2015-06-30   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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金针菇菇脚蛋白质的提取


０　引　言现今金针菇工厂化栽培规模逐渐扩大，如何有效含有多种功能性蛋白的利用金针菇菇脚等副产物成为企业的关注重点. 碱溶酸沉法、酶解法、超声波萃取法［１］、反胶束法［２］、盐溶法［３］和膜分离法［４］是植物蛋白提取的主要方法. 已有文献报导通过正交实验确定碱法提金针菇菇脚蛋白质的最佳条件［５］. 但是利用响应面法优化金针菇菇脚蛋白提取工艺的报道少见，在此背景下，本实验以金针菇工厂加工剩余的金针菇菇脚作原料，探讨对金针菇菇脚蛋白提取率有较显著影响的因素，再利用响应曲面法对提取工艺进行优化，获得最优的提取参数，以期能充分利用金针菇的副产物，降低其对环境的危害的同时，提高农户和企业的经济效益. １ 实验部分１．１　材料１．１．１　原料　 金针菇菇脚（菌柄基部１～３ ｃｍ）由武汉如意食用菌生物高科技有限公司提供. １．１．２　试剂　 氢氧化钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、考马斯亮蓝Ｇ－２５０（分析纯）、磷酸（分析纯）、盐酸（分析纯），皆为市售. １．２　方法１．２．１　实验材料的预处理　 将新鲜金针菇菇脚晾晒至半干后，放于烘箱中６０　℃鼓风烘干，然后经高速万能粉碎机粉碎，ｄ＜０．１５ ｍｍ筛分，制得金针菇菇脚粉末，置于干燥器中保存备用. １．２．２　菇脚蛋白质的提取　 取制备好的金针菇菇脚粉末１ ｇ置于锥形瓶中，加入一定质量浓度的ＮａＯＨ溶液，于一定温度下水浴浸提一段时间后，经布氏漏斗加压抽滤，收集滤液. 将滤渣碱液重复提取１次，合并２次提取液即为菇脚蛋白质提取液. １．２．３　单因素试验设计　 分别测定液料比（１∶１、１５∶１、２０∶１、２５∶１、３０∶１ ｍＬ/ｇ）、ＮａＯＨ浓度（０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｇ/１００ ｍＬ）、提取温度（４０、５０、６０、７０、８０ ℃）、提取时间（１、２、３、４、５ ｈ）、提取次数（１、２、３、４次）对金针菇菇脚蛋白质提取率的影响. １．２．４　响应面优化法　 根据单因子试验的结果，选取对实验有较显著影响的因素和水平，由Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计出分析因素与水平表（表１），再运用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｏｒｔ ８．０分析实验结果. 各因素的试验水平及编码列于表１. 其中Ａ、Ｂ、Ｃ分别表示提取温度（℃）、提取时间（ｍｉｎ）及液料比（ｍＬ／ｇ）. １．２．５　蛋白质含量的测定 　以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法［６］测定蛋白质含量. １．２．６　蛋白提取率的计算　 按照１．２．５中方法测定提取液的吸光度值，并根据标准曲线方程计算出稀释１　０００倍后提取液中蛋白的质量. 金针菇菇脚蛋白提取率计算公式如下： 金针菇菇脚蛋白提取率/％＝ ■×100%表1　碱提法提取金针菇菇脚蛋白响应面分析因素与水平表Table 1　Coded variables and their coded levels in RSM２　结果和分析２．１　菇脚蛋白的单因子实验结果２．１．１ 菇脚蛋白质提取率受液料比的影响　　确定ＮａＯＨ溶液质量浓度＝０．５ ｇ/１００ ｍＬ，提取温度为７０　℃，提取时间２ ｈ，提取次数２次，在此条件下测定不同液料比对金针菇菇脚蛋白质的提取率. 由图１可以看出，当液料比增加时，蛋白质的提取率呈增加趋势. 图１　金针菇菇脚蛋白质提取率受液料比的影响Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆ． ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ’ｓｔｉｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．１．２　菇脚蛋白质提取率受ＮａＯＨ浓度的影响　确定液料比为２０∶１，提取温度７０　℃，浸提时间２ ｈ，提取次数２次，在此条件下，测定不同 ＮａＯＨ浓度下菇脚蛋白质的提取率. 实验结果显示，ＮａＯＨ质量浓度为０．５ ｇ/１００ ｍＬ之前，蛋白质的提取率随着ＮａＯＨ浓度的增加而增加；ＮａＯＨ质量浓度 ０．５ ｇ/１００ ｍＬ之后，随着ＮａＯＨ浓度的增加，提取率反而有所下降（图２）. ２．１．３　菇脚蛋白质提取率受温度的影响　 在液料比２０∶１，ＮａＯＨ质量浓度为０．５ ｇ／１００ ｍＬ，浸提时间为２ ｈ，提取次数２次条件下，测定不同提取温度对蛋白提取率的影响试验结果显示，当提取温度增加时，蛋白质的提取率呈上升趋势. 在温度为６０ ℃之前，蛋白质的提取率增加的幅度较大；温度为６０ ℃之后，提取率增加的幅度开始降低 （图３）.图２　金针菇菇脚蛋白质提取率受ＮａＯＨ质量浓度的影响Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮａＯＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆ． ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ’ｓｔｉｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ图３　金针菇菇脚蛋白质提取率受温度的影响Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆ． ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ’ ｓｔｉｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２．１．４　菇脚蛋白质提取率受时间的影响　在液料比２０∶１，每100 mL为ＮａＯＨ质量为０．５ ｇ，提取温度为７０ ℃，提取次数２次条件下，测定不同提取时间下菇脚蛋白提取率的变化. 结果显示，提取时间越长，蛋白质提取率增长趋势越缓慢（图４）. 图４　金针菇菇脚蛋白质提取率受时间的影响Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆ． ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ’ ｓｔｉｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２．１．５　菇脚蛋白质提取率受次数的影响　 在液料比２０ ｍＬ／ｇ，ＮａＯＨ质量浓度为每１００ ｍＬ ０．５ ｇ，提取温度为７０ ℃，浸提时间为２ ｈ条件下，测定不同提取次数下菇脚蛋白提取率的变化. 结果表明，当提取次数增加，蛋白质的提取率呈先增加后趋于平缓的趋势（图５）. 图５　金针菇菇脚蛋白质提取率受次数的影响Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｆ． ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ’ ｓｔｉｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２．２　响应面实验结果根据单因素实验结果不显著因素条件确定提取液ＮａＯＨ质量浓度、提取次数分别为，ＮａＯＨ为０．５ ｇ每１００ ｍＬ、提取次数２次. 选取有显著影响的液料比、提取温度、提取时间３个因素为响应面优化法的因素水平，金针菇菇脚蛋白质提取率为因变响应值（ｙ），响应曲面实验设计及其结果见下表２. 表2　Box-Behnken试验设计及结果Table.2　Experimental designs and results of Box-Behnken实验数据运用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８．０软件分析，建立金针菇菇脚蛋白提取率与提取温度（Ａ）、提取时间（Ｂ）、液料比（Ｃ） ３个因素的数学回归模型：Y=+2.160+0.400A+0.033B+0.440C+0.035AB-0.300AC-0.017BC-14.80A2-2.350B2-2.800C2 该方程中的系数表示各个因素对实验结果的影响程度，由此方程可以预测得到各个不同条件组合下金针菇菇脚蛋白的提取率. ２．３　回归模型的方差分析对所得回归模型进行方差分析，结果如下表３所示. 表3　回归模型的方差分析Table3　ANOVA for Response Surface Quadratic Model２．３．１　单因素对实验结果的影响 　通过方差分析表，由Ｆ检验，可以得出Ａ－提取温度、Ｃ－液料比对金针菇菇脚蛋白提取率的影响均为极显著，而Ｂ－提取时间对金针菇菇脚蛋白提取率的影响不那么显著. 三个因素对提取质量的影响的显著性依次是：Ｃ＞Ａ＞Ｂ，即液料比＞提取温度＞提取时间. ２．３．２　交互项对实验结果的影响　　在响应面的分析中，由等高线的图形和颜色可以看出交互作用的显著与否. 图形愈椭圆体现出交互作用愈强，愈趋向圆形就愈弱. 再来分析图的颜色，由蓝变红则提取率从小变大，变的愈快显示坡度愈大，表示影响实验结果更显著，等高线代表的是在一条线上所有的组合方案得到的蛋白质提取率都一样. 图６～８表明，提取温度（Ａ）和液料比（Ｃ）之间的交互作用显著（ｐ＜０．０５），表现为等高线呈椭圆形，颜色变化更为分明. 提取温度（Ａ）和提取时间（Ｂ）、提取时间（Ｂ）和液料比（Ｃ）相对而言交互作用不显著. 图７是在提取时间为２ ｈ时，提取温度（Ａ）和液料比（Ｃ）交互作用对菇脚蛋白提取率影响的曲面图和等高线图. 由图可知，随提取温度的增加，菇脚蛋白质的提取率变化为先增加后降低. 当液料比较低时，得率变化很小，表现为响应曲面平滑，说明提取温度对菇脚蛋白提取率影响不显著；而当液料比逐渐增加这种变化趋势较为明显，表现为响应曲面变陡，说明提取时间对菇脚蛋白提取率影响显著. 在液料比为２０∶１时提取率达到最高；当液料比进一步增加，这种变化趋势开始减缓，响应曲面表现为平滑. 当提取温度渐渐上升，液料比对提取率的影响呈现相似的效应. 等高图的中心位置即提取温度６０　℃、液料比２０∶１是提取率的较高点.２．３．３　响应面模型评估　　从表４可信度分析结果可知， Ｒ２（Ｐｒｅｄ Ｒ－Ｓｑｕａｒｅ）达到０．９３６　７，表明新观测值的好坏可以较好地被此模型所预测.图６　对蛋白提取率受时间和温度交互作用的影响Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ图７　蛋白提取率受温度和液料比交互作用的影响Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ图８　蛋白提取率受时间和液料比交互作用的影响Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎＲ２（ Ｒ－Ｓｑｕａｒｅ）达到０．９９５　６，表明实验所试验点的适配度为９９．５６％，模型拟合度很高，实验误差较小. 修正Ｒ２（Ａｄｊ Ｒ－Ｓｑｕａｒｅ）为０．９８７　７，表明９８．７７％的试验数据变异性可以被解释. 同时Ｒ２（ Ｒ－Ｓｑｕａｒｅ）与修正Ｒ２（ Ａｄｊ Ｒ－Ｓｑｕａｒｅ）两值接近，更说明建立的模型拟合性好、可靠. Ａｄｅｑ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＞ ４表明该模型具有足够分辨力，这个模型可以用于实践. 以上几个重要的评估模型好坏的参数均说明本模型拟合较好，适合对金针菇菇脚蛋白提取工艺进行分析和预测. 表4　回归模型的评估Table4　The assessment of the regression model２．３．４　响应面验证试验　　根据回归方程：Y=+2.160+0.400A+0.033B+0.440C+0.035AB-0.300AC-0.017BC-14.80A2-2.350B2-2.800C2 可以得到提取的最优条件. 由回归方程可得：　　０．０４０－２．９６０Ａ＋０．０３５Ｂ－０．３００Ｃ＝０ （１）　　０．０３３＋０．０３５Ａ－４．７００Ｂ－０．０１７Ｃ＝０ （２）　　０．４４０－０．３００Ａ－０．０１７Ｂ－５．７８０Ｃ＝０ （３）将式（１）、（２）、（３）联立方程组，解得Ａ＝０．１３０，Ｂ＝０．００８，Ｃ＝０．０６８，将编码值转换成实际条件得到提取温度＝６１．３０ ℃，提取时间＝２．０１ ｈ，液料比为２０．３４ ｍＬ／ｇ. 将上述优化的提取条件进行菇脚蛋白质的提取实验，来验证响应面模型所得数据的可靠性. 但为实际操作方便，将提取金针菇菇脚蛋白的最佳工艺条件修正为：提取温度６１　℃，提取时间２ ｈ，液料比２０ ｍＬ／ｇ. 在此条件下蛋白质实测提取率为１２．０７％，而由回归模型所预测的理论提取率为１２．２０％，理论预测值比实际测定值高１．０７％. 显示各个因素同菇脚蛋白质提取率之间的关系可以很好的被该模型所预测. 以上可以说明，由响应曲面分析法优化得到了确信可靠的菇脚提取参数，且得到了适配性良好的回归模型. ３　结　语本研究的目的是对金针菇菇脚蛋白的提取工艺进行优化，通过单因素实验对液料比、ＮａＯＨ浓度、浸提温度、浸提时间和浸提次数进行分析，得到单因素实验下菇脚蛋白提取率的变化趋势图. 在此结果上选择有显著影响的三个因素提取温度、提取时间和液料比，运用响应面分析法进行进一步研究. 通过以提取温度（５０～７０　℃）、提取时间（１～３　ｈ）、液料比（１５～２５ ｍＬ／ｇ）作为提取的因素和水平，用响应面法进行三因素三水平的优化设计实验. 通过借助Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｏｒｔ ８．０的分析我们可以得到以下结论：ａ．各个因素对菇脚蛋白提取率的影响为：液料比＞提取温度＞提取时间.ｂ.提取温度和液料比的交互作用对菇脚蛋白质提取率有显著影响，其他任意两项的交互作用对菇脚蛋白质提取率无明显影响.ｃ.实验优化的提取菇脚蛋白的提取工艺条件是：液料比２０∶１ ｍＬ/ｇ、ＮａＯＨ质量浓度为０．５ ｇ/１００ ｍＬ、提取温度６１ ℃、提取时间２ ｈ、提取次数为２次，理论上最佳提取率为１２．２０％. 在此条件下菇脚蛋白的实测提取率为１２．０７％，误差在可接受范围内. 说明本模型拟合很好，为分析和预测金针菇菇脚蛋白质的提取工艺提供了理论依据. 致　谢感谢武汉工程大学研究生处对本研究提供的资助！