《武汉工程大学学报》 2015年07期
11-15
出版日期：2015-07-31
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Ｇｐ６４基因的原核表达
０ 引 言苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）是杆状病毒科核型多角体病毒属的典型代表，该病毒的基因组为１３４ ｋｂ的环状单一双链ＤＮＡ分子. 由于ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ含有大量多克隆序列，这些序列不是病毒ＤＮＡ复制所必需的，能容许基因缺失或替换，故常用作外源基因的表达载体［１－３］. ＡｃＭＮＰＶＣ在感染宿主后有非包涵体病毒（ＢＶ） 和包涵体病毒（ＯＶ） 两种表现型［４－５］. Ｇｐ６４蛋白是ＢＶ的重要组成部分，由５１２个氨基酸残基构成，其分子量约为６４ ｋＤ. Ｇｐ６４蛋白是第三类过滤性的膜融合蛋白，主要以二硫键相连的三聚体形式存在于杆状病毒ＢＶ颗粒的一端，ＧＰ６４基因是杆状病毒结构蛋白基因中唯一既有早期启动子又有晚期启动子的基因，是病毒通过吸附、包吞作用进入宿主细胞的关键功能蛋白基因之一［６－７］，在病毒吸附内吞进入宿主细胞的过程中，依赖环境中的酸性ｐＨ，通过与膜融合使病毒粒子进入细胞［８］. 本研究通过ＰＣＲ扩增ＡｃＭＮＰＶ Ｇｐ６４ 基因中长度为９６３ ｂｐ的 ＤＮＡ 片段，利用软件计算其编码的蛋白质分子量约４０ ｋＤ，将该基因克隆到原核表达系统中并成功表达截短的Ｇｐ６４基因，用透析袋电洗脱法对表达的目的蛋白进行纯化，获得较纯净的Ｇｐ６４蛋白，利用该蛋白进行大白兔免疫实验制备抗Ｇｐ６４蛋白抗体［９］. １ 实验部分１．１ 材料大肠杆菌质粒ｐＥＴ２８ａ由华中农业大学生命科学院提供，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ 由南阳理工师范学院提供，大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）和克隆型ＤＨ１０Ｂ菌株由本实验室保存. 实验过程所需要的限制性内切酶，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，ＤＮＡ、蛋白质Ｍａｒｋｅｒ以及ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔ载体）均购自宝生物有限公司. １．２ 方法１．２．１ 有ＡｃＭＶＰＶ Ｂａｃｍｉｄ全基因组提取 具体ＡｃＭＶＰＶ Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ抽提方法参见Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＢＥＶＳ ａｎｄ Ｉｎｓｅｒｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ. １．２．２ 引物设计及ＰＣＲ 根据在ＮＣＢＩ上面搜索出的１５００ ｂｐ大小Ｇｐ６４基因的ＤＮＡ序列，去掉其跨膜区域周围约５００个碱基. 利用ＤＮＡｍａｎ分析其酶切位点，通过Ｏｌｉｇｏ６．０设计１对特异性引物，引物两端分别添加ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ限制酶切位点，由武汉安基生物公司合成：上游引物为５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡ－３；下游引物为：５’－ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡ－３＇.用实验室保存的菌种提取的ＡｃＭＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ质粒为模板，通过ＰＣＲ合成Ｇｐ６４基因，扩增的目的片段大小为９６３ ｂｐ. ＤＮＡ变性温度为９５ ℃ ３ ｍｉｎ；ＰＣＲ共进行３１个循环：９４ ℃ １ ｍｉｎ，５０ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，最后再在７２ ℃ 进行延伸反应１０ ｍｉｎ，４ ℃保存备用. １．２．３ Ｇｐ６４基因表达载体的构建 将特异性片段进行Ｔａ克隆，验证得到的正确克隆产物进行Ｓａｌ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切，对酶切产物进行凝胶回收纯化后与经过Ｘｈｏｌ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ双酶切和凝胶回收的原核表达载体ｐＥＴ２８ａ进行连接反应，反应体系１０ μＬ. 将连接产物转化到ＤＨ１０Ｂ感受态细胞，培养１２ ｈ后对平板上的菌落进行鉴定，包括菌ＰＣＲ检测，酶切验证和测序验证，对目的重组质粒命名为ｐＥＴ２８ａ－Ｇｐ６４［１０］. 其中ＤＮＡ纯化过程参见天根凝胶回收试剂盒，其它实验步骤参见第三版分子克隆手册. １．２．４ Ｇｐ６４基因的诱导表达及电透析纯化 制备野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ ＤＥ３） 感受态细胞，用于重组质粒ｐＥＴ２８ａ－Ｇｐ６４的转化. 培养１２ ｈ后挑取鉴定正确的目的克隆菌接种于１０ ｍＬ ＬＢ培养基中，３７ ℃ 摇床培养过夜， 次日按体积比１０％转接到１００ ｍＬ的ＬＢ培养基中培养３ ｈ，并向菌液中加入终浓度为０．３ ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ［１１］，在此作对照试验，其中选择相同的样品不加入诱导剂. ３０ ℃，２００ r/min诱导表达５ ｈ 后，收集菌液并处理样品［１２］. 对处理后的样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析. 收集表达细菌，６ ０００ r/min离心１０ ｍｉｎ后称重. １ ｇ细菌量用２０ ｍＬ的缓冲液ＰＢＳ重悬. 混匀后超声破碎细胞超声５ ｓ，间隙５ ｓ，１０ ｍｉｎ后６ ０００ r/min室温离心１０ ｍｉｎ. 再用２０ ｍＬ的漂洗缓冲液（２ mol/L尿素，质量分数０．５％曲拉通，１ ｍmol/L ＥＤＴＡ）重悬后混匀将得到的较纯净的Ｇｐ６４蛋白染色后点样，大概点样５００ μＬ，将得到的胶块考马斯亮蓝染色１５ ｍｉｎ. 脱色过夜至蛋白胶无蛋白位置无色. 将目的蛋白所在的区域用洁净的小刀切下来，装入处理好的透析袋中，加入１ ｍＬ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙ缓冲液，置４ ℃ ３０ ｍｉｎ. 取事先放置在４ ℃的Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙ缓冲液加入到核酸电泳仪，将含有目的蛋白的透析袋放入，电泳２～３ ｈ，每间隔１ ｈ更换预冷的缓冲液. 电泳结束后，将透析袋放入ｐＨ８．０的ＰＢＳ缓冲液中透析过夜. 透析结束后，取透析液蛋白电泳分析纯化结果［１３］. １．２．５ 抗Ｇｐ６４蛋白抗体制备及特异性检测 以Ｇｐ６４蛋白为抗原，进行大白兔免疫实验. 汲取１ ｍＬ蛋白溶液（４００~６００ ｎｇ/ｍＬ）对大白兔进行双腿静脉注射. 在饲养间隔１４ d和２８ d后进行第1次和第2次加强针注射. 继续培养１１ d后取静脉血，收集抗体进行抗体利用蛋白印记进行特异性检测. 其中特异性一抗１∶４ ０００进行稀释. 羊抗兔二抗１∶８ ０００进行稀释. ２ 结果和分析２．１ 重组质粒ｐＥＴ２８ａ－Ｇｐ６４的构建 图１、２为重组质粒ｐＥＴ２８ａ－Ｇｐ６４的构建的电泳图. 图1 全长和截短Gp64DNA序列PCR电泳图Fig.1 PCR-Electrophoreses about Gp64 and truncate Gp64 DNA sequence图2 Gp64和pET28a凝胶回收后电泳图Fig．2 Electrophoreses after gel extraction about Gp64 and pET28aＰＣＲ后通过电泳得到截短Ｇｐ６４ＤＮＡ图，结果显示与预期结果相同，在１ ０００ ｂｐ左右位置有亮带. 所需要的目的ＤＮＡ经过凝胶电泳纯化，通过ＤＮＡ电泳可知纯化得到的较纯净的ＤＮＡ，用于做连接反应，目的在于增加连接效率. ２．２ 重组质粒ＰＣＲ检测和酶切检测 挑选３个重组子做菌落ＰＣＲ检测，其结果如图３所示，都能扩增出很明显的目的片段. 然后，将选择１、２号进一步进行酶切检测，分别采用ＥｃｏＲ Ｖ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切，ＥｃｏＲ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｖ单酶切. 根据质粒图谱分析重组子采用ＥｃｏＲ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｖ单酶切出现６ ３００ ｂｐ左右条带；采用ＥｃｏＲ Ｖ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切出现１ ３８１ ｂｐ和４ ９１４ ｂｐ条带. 选择正确的重组子进行测序检测，捕获所需要的目的重组子. ２．３ 目的蛋白的表达及纯化 通过诱导实验，对样品进行相同处理后，采用质量分数１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图得到如下图５所示，其中加入诱导剂进行诱导的菌种在２９~４４ ｋＤ之间明显产生大量的蛋白质，与理论上目的蛋白４０ ｋＤ相符合. 所以目的蛋白成功诱导表达. 图６显示，经过电透析纯化的蛋白纯度较高，符合下一步实验的要求.２．４ 抗体的制备及特异性检测 利用制备的抗体进行ＷＢ实验结果如下图所示，其中检测抗原为电透析纯化的Ｇｐ６４蛋白. 图７说明制备的抗体具有识别Ｇｐ６４蛋白能力，该图中抗原按照一定的稀释度点样，当样品量高时，得到的条带不单一表明抗体的纯度不高. 由于免疫试验所提供的蛋白纯度不够，杂蛋白对抗体的特异性有一定的影响. 可以利用电透析纯化的目的蛋白对所制备的抗体进行纯化，增加抗体的特异性. 图3 PCR检测重组子电泳图片Fig.3 PCR electrophoreses about recombination bacterial colony图4 酶切检测重组子电泳图片Fig.4 Electrophoreses about recombination DNA图5 目的蛋白诱导表达Fig.5 Expression about purpose protein图6 目的蛋白纯化图片Fig.6 Purification about purpose protein图7 蛋白印迹Fig.7 Western Blot３ 讨 论Ｇｐ６４蛋白是核型多角体病毒囊膜上的一个经糖基化修饰的功能蛋白， 在病毒入侵宿主细胞和出芽型病毒转运过程中都起重要作用［１４］. 为了进一步研究杆状病毒Ｇｐ６４蛋白在病毒感染宿主过程表达检测及寻找其相互作用蛋白， 制备高效价的抗Ｇｐ６４蛋白抗体是极为重要的一步. 我们对Ｇｐ６４基因的完整读码框进行扩增， 并将构建的重组载体导入ＢＬ２１（ ＤＥ３）表达菌，多次对诱导条件进行摸索， 同时更换表达菌等尝试无法获得原核表达的Ｇｐ６４蛋白（结果未显示）. 分析原因可能是Ｇｐ６４蛋白为囊膜蛋白，它的跨膜区域会阻止蛋白质的折叠，从而影响目的蛋白的合成［１０－１１］；其次稀有密码子对蛋白翻译的影响，目标蛋白跨膜区域周围存在较多的稀有密码子，在翻译时出现了翻译障碍导致蛋白合成终止而无法正常合成目的蛋白［９］. 通过分析，切除其跨膜区域后，将重新构建的重组子导入到ＢＬ２１表达菌中实现了Ｇｐ６４截短蛋白基因在大肠杆菌中的表达. 对表达的蛋白进行电透析纯化. 其中使用６×Ｈｉｓ标签进行纯化，但是表达的蛋白为包涵体蛋白，在洗涤变性过程中，高盐浓度对于镍柱吸附效率影响很大，纯化量及纯度远远达不到要求（结果未显示），故采用电透析纯化. 利用该蛋白进行大白兔免疫实验得到了特异性结合Ｇｐ６４蛋白的抗体，为Ｇｐ６４蛋白后续的表达检测及研究其相互作用的蛋白奠定了基础. 致 谢 感谢湖北省科技厅的资助！