《武汉工程大学学报》 2015年12期
6-9
出版日期：2016-01-14
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
正交试验优选虎杖总黄酮的提取工艺
０ 引 言 虎杖为蓼科植物虎杖Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．的干燥根茎和根．我国大部分地区均产，主产于江苏、江西、山东、四川等地［１］．虎杖具有泻下、祛痰止咳、降压、止血、镇痛等药理作用，它的主要成分包括虎杖苷、黄酮类、大黄素、大黄素甲醚、白藜芦醇、多糖．据文献报道，黄酮类化合物具有抗氧化、调节心血管系统、镇痛、利胆保肝、调节内分泌系统等作用［２－３］．现代研究表明，黄酮类化合物具有良好的抗病毒作用［４－５］．本研究采用正交试验法，分别对超声法和冷浸法提取虎杖总黄酮的工艺参数进行了优化，同时对两种提取方法的效果作了比较，为虎杖总黄酮的进一步开发利用奠定了一定的实验基础．１ 实验部分 １．１ 仪器与试剂Ｔ６新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ＫＱ－２５０型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ＤＺＦ－６０９０真空干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）．虎杖购于武汉市传奇春天大药房，产地四川，经武汉工程大学黎莉教授鉴定为蓼科植物虎杖Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．的干燥根茎和根；芦丁对照品（供ＵＶ法测定，质量分数为９２．６％，中国食品药品检定研究院，批号：１０００８０－２０１４０９）；其余试剂均为分析纯．１．２ 正交试验设计通过预实验，选定乙醇质量分数（Ａ）、料液比（Ｂ）、提取时间（Ｃ）为考察因素，虎杖总黄酮含量为考察指标，按照Ｌ９（３３）正交表设计，超声提取因素水平表见表１，冷浸提取因素水平表见表２．表1 超声提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction表2 冷浸提取因素水平Table 2 Factors and levels of cold soak extraction１．３ 总黄酮含量测定１．３．１ 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品２１．６ ｍｇ，加少量质量分数６０％乙醇溶解后置于１００ ｍＬ容量瓶中并定容，摇匀，即得芦丁对照品溶液的质量浓度为０．２ ｍｇ·ｍＬ－１．１．３．２ 测定吸收波长的确定 精密量取上述芦丁对照品溶液１ ｍＬ，置于２５ ｍＬ容量瓶中，加蒸馏水至６ ｍＬ，加质量分数５％ ＮａＮＯ２ 溶液１ ｍＬ，充分摇匀后静置６ min；加质量分数为１０％ Ａl（ＮＯ３）３溶液１ ｍＬ，摇匀，静置６ ｍｉｎ；加质量分数４％ ＮａＯＨ溶液１０ ｍＬ，再加蒸馏水定容至刻度，摇匀后静置１５ ｍｉｎ，以未加芦丁对照品试液作空白对照，于４００~８００ ｎｍ波长范围内进行光谱扫描，结果显示在５００ ｎｍ处有最大吸收峰，故选择５００ ｎｍ为测定波长．１．３．３ 标准曲线的绘制 精密量取芦丁对照品溶液０、１、２、３、４、５、６ ｍL，按照“1.3.2”步骤操作，以未加芦丁对照品的试液作空白对照，在 ５００ ｎｍ处测吸光度，纵坐标为吸光度Ａ，横坐标为芦丁质量浓度，绘制标准曲线，通过拟合得线性回归方程为：Ａ＝１２．２８２Ｃ－０．０２０ １，Ｒ２＝０．９９９ ６． 结果表明芦丁对照品在０．００８～０．０４８ ｍｇ·ｍＬ－１质量浓度范围内与吸光度线性关系良好．１．３．４ 供试品溶液的制备 准确称取干燥过孔径０．４２５ ｍｍ筛虎杖约１．００ ｇ，按正交试验表中条件提取，提取液过滤后定容至１００ ｍＬ容量瓶中，即得供试品溶液．１．３．５ 样品含量测定 精密量取上述供试品溶液０．５ ｍＬ，按“１．3．３”项下方法测定吸光度，根据回归方程可计算总黄酮含量．１．４ 方法学考察１．４．１ 精密度试验 精密量取同一供试品溶液６份，每份０．５ ｍＬ，分别置于２５ ｍＬ容量瓶中，按“１．２．３”项下方法测定吸光度．结果，ＲＳＤ＝１．４５６％ ，表明该方法有较好的精密度．１．４．２ 稳定性试验 精密量取供试品溶液０．５ ｍＬ，置于２５ ｍＬ容量瓶中，按“１．3．３”项下方法每隔５ ｍｉｎ测定一次吸光度，共测６次．结果，ＲＳＤ＝１．１８５％ ，表明样品的稳定性良好．１．４．３ 重复性试验 平行制备６份供试品溶液，按“１．3．３”项下方法测定吸光度．结果，ＲＳＤ＝１．８５７％，表明该方法重复性较好．１．４．４ 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液６份，每份０．２５ ｍＬ，分别精密加入一定量的芦丁对照品溶液，按“１．3．３”项下方法测定吸光度．结果，平均回收率为９９．２０８％，ＲＳＤ＝０．９８８％，表明该方法回收率高．２ 结果与讨论２．１ 正交试验结果及分析正交试验结果见表３，方差分析结果见表４．由表３和表４得出，超声法中ＲＢ＞ＲＡ＞ＲＣ，表明影响总黄酮提取率的因素顺序为料液比＞乙醇质量分数＞提取时间．可知对总黄酮提取率的影响较大的是料液比、乙醇质量分数，提取时间对总黄酮提取率的影响较小，但由于试验次数较少，均未见显著性差异．因此，超声法最佳提取工艺为Ａ３Ｂ３Ｃ１，即乙醇质量分数８０％，料液比１∶５０，提取时间１０ ｍｉｎ．冷浸法中ＲＢ＞ＲＡ＞ＲＣ，表明影响总黄酮提取率的因素顺序为料液比＞乙醇质量分数＞提取时间．可知对总黄酮提取率的影响较大的因素为乙醇质量分数、料液比，提取时间对总黄酮提取率的影响较小，但由于试验次数较少，均未见显著性差异．因此，冷浸法最佳提取工艺为Ａ３Ｂ３Ｃ２，即乙醇质量分数８０％，料液比１∶５０，提取时间２４ ｈ．由上述实验结果可知，超声法和冷浸法对总黄酮提取率的影响因素相似． 但超声法提取效果优于冷浸法，且超声提取时间较短，故虎杖总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇质量分数８０％、料液比为１∶５０、超声提取１０ ｍｉｎ．２．２ 验证试验准确称取干燥虎杖（过孔径０．４２５ ｍｍ筛）约１．００ ｇ，按超声法最佳提取工艺Ａ３Ｂ３Ｃ１平行操作３次，其总黄酮平均提取率为１９．３１％，ＲＳＤ＝１．１６％． 验证试验结果与正交试验结果基本一致，表明该提取工艺稳定可行．表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis３ 结 语本实验通过正交试验分别考察了虎杖总黄酮的超声法和冷浸法提取提取工艺，比较两种总黄酮提取的工艺可以看出，超声法提取效果优于冷浸法，并获得虎杖总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇质量分数８０％、料液比１∶５０、超声提取１０ ｍｉｎ．在该条件下，总黄酮提取率为１９．３１％．本实验优选的虎杖中总黄酮的提取工艺操作简单、提取率高，并为虎杖中总黄酮的后续开发研究提供了一定的实验基础．