《武汉工程大学学报》 2020年05期
473-477
出版日期：2021-01-29
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
粒径可控的TeO2纳米颗粒合成及其抗耐药菌活性研究
抗生素的大量使用使越来越多的细菌对抗生素产生耐药性［1］。细菌耐药不仅使治疗药物剂量加大、治疗时间延长，而且会出现治疗失败［2-3］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）是最常见的临床耐药菌之一，从1961年被发现至今感染遍及全球［4］。MRSA能引起皮肤和软组织感染、脑炎等，严重威胁人类健康。传统治疗金黄色葡萄球菌感染的抗生素大多为β-内酰胺类，但对MRSA的抗菌作用大大降低，寻求新的抗MRSA药物迫在眉睫［5-7］。无机纳米材料由于其尺寸小、比表面积大、广谱抗菌性及不易产生耐药性等优点为治疗耐药菌感染提供了新的策略［8］。碲稳定性高，是人体中第四大微量元素，生物安全性好，其化合物很早被用于治疗感染疾病，如麻风病、结核病等［9-10］。无机纳米二氧化碲（TeO2）具有轻质、高强度及高比表面积的特点，广泛应用于诸多新兴领域，如用于制备半导体、热电转换元件、红外探测器等［11-13］。同时，TeO2也被用于抗菌方面，如Zhong等报道了2种不同类型的纳米TeO2颗粒溶液对临床分离的革兰氏阳性和阴性病原菌株均能抑制生长［14］，但是研究较少。目前，TeO2纳米颗粒的制备多采用水热法、溶剂热法、气相沉积法、电化学法等［15-17］。然而，这些方法操作繁琐、能耗高、产能低，满足不了大量高效制备TeO2纳米颗粒的要求。气溶胶法是一种常在实验室和工业生产中生产纳米材料的方法，其制造的纳米材料广泛用于气体吸附、催化剂、药物传递和控制释放、抗菌涂料、自清洁材料、空气净化和水处理等领域［18］。使用气溶胶法制备纳米材料具有工艺流程短、反应时间短、成本较低、不对环境造成污染、副产物少等优点。基于此，本研究通过控制不同的反应温度，使用气溶胶法一步合成不同尺寸的TeO2纳米颗粒，并测定其对MRSA的抗菌作用，丰富具有抗耐药菌活性的无机合成纳米材料种类。1 实验部分1.1 仪器与试剂MRSA临床菌株由武汉市第三人民医院提供并鉴定；碲酸（H2TeO4），亚碲酸钠（Na2TeO3）（阿拉丁试剂有限公司）；商用TeO2 （西格玛奥德里奇贸易有限公司）；Mueller-Hinton（MH）培养基（AOBOX有限责任公司）；琼脂糖，氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾均（国药集团化学试剂有限公司）。D8 ADVANCE 型 X-射 线 衍 射 仪（X-ray diffraction，XRD，德国Bruker公司）；S-4800型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，日本日立公司）；722 N紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。OTL-1200型高温管式炉（南京博蕴通仪器科技有限公司）。1.2 TeO2纳米颗粒的制备按图1搭建装置进行合成［19］。将碲酸粉末溶解于去离子水中，配成质量浓度为100 mg/mL的溶液，在纯度为99.999%、压力为200 kPa，氮气保护下，通过单喷嘴喷雾器雾化成气溶胶液滴（流速为6.5 L/min，生成粒子浓度范围为107个/厘米3），液滴通过导管进入微波发生器（功率为800 kW）进行干燥，随后附于氮气上进入高温管式炉中（电阻加热型，选择温度分别为400、500、600、700、800、900 ℃）反应1 s，经过热分解及烧结、熔融等过程后生成TeO2纳米颗粒，最后由单层板过滤器进行收集。[加热室][微波室][雾化器][载气][进料管][前驱体溶液][过滤器][尾气][微粒收集]图1 气溶胶法合成装置Fig. 1 Schematic diagram of synthesis of tellurium dioxide nanoparticles by an aerosol method 1.3 样品表征采用XRD对所合成的样品组成进行分析，扫描角度为10°~80°；采用SEM对样品的形貌及大小进行分析。1.4 TeO2纳米颗粒的抗菌活性1.4.1 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）测定 在无菌试管中加入1 mL浓度为106 CFU/mL（colony forming unit，CFU，菌落形成单位）的MRSA菌液，分别加入1 mL不同质量浓度（2~512 μg/mL）的TeO2溶液（用MH培养基配制），混合均匀后放于37 ℃，200 r/min恒温摇床震荡培养24 h。观察试管中溶液的浑浊度，以溶液澄清透明试管对应的TeO2浓度为MIC。实验重复3次。1.4.2 抗菌活性比较 选取了1 mL质量浓度为 32 μg/mL的商用TeO2、碲酸、亚碲酸钠、MIC最小的合成TeO2、纳米银（文献方法合成［20］）以及16 μg/mL的纳米银（用MH培养基配制），再分别与1 mL 106 CFU/mL的MRSA溶液混合，在37 ℃，200 r/min恒温摇床震荡培养3 h，稀释涂板计数。实验重复3次，取平均值。以不添加药物的试管为对照组。2 结果与讨论2.1 样品表征图2是不同温度下气溶胶法制备的样品的XRD图谱。由图2可知，在不同温度条件下的TeO2纳米颗粒，在26.2°、29.9°、37.3°、48.5°和55.2°出现的衍射峰均与副黄碲矿型TeO2标准卡片图谱（JCPDS 84-1777）的110、102、200、212及114晶面对应；同时，不同温度条件下合成的样品图谱未出现其他杂峰，表明合成了结晶度较高的TeO2。这是因为采用气溶胶法合成TeO2纳米颗粒时，前驱体为H2TeO4溶液，合成过程中未使用其他化学试剂，并且400 °C就能有效分解H2TeO4，生成纯净的TeO2。[10 20 30 40 50 60 70 802θ / （°）][Intensity （a.u.）][900 ℃][800 ℃][700 ℃][600 ℃][500 ℃][400 ℃][JCPDS 84-1777 TeO2]图2 不同温度合成的TeO2纳米颗粒的XRD图Fig.2 XRD patterns of TeO2 nanoparticles synthesized at different temperatures采用SEM观察不同温度合成的TeO2的形貌。由图3可知，在温度为400 ℃时，生成的TeO2纳米颗粒粒径较大且分布不均，大部分颗粒粒径在600 nm左右；随着温度从400 ℃升高到900 ℃，粒径分布逐渐均一，并且纳米颗粒的平均粒径逐渐减小，从600 nm降到30 nm。此外，随着温度由700 ℃升高到900 ℃时，TeO2粒径显著降低，从250 nm减小到100 nm；温度在升高时，粒径减小幅度降低。这是由于H2TeO4溶液变为气溶胶后，在管式炉中停留时间保持一致，不同的炉温使得气溶胶液滴在蒸发、沉淀、热分解及烧结、熔融等各个阶段的停留时间不同［21］，液滴之间发生碰撞凝聚不同，最终导致TeO2纳米颗粒的粒径分布的不同。在温度较低时，TeO2处于液滴状态时间长，液滴之间碰撞合并为更大液滴的概率增大，进而成核速度慢，成核数量少，使得生成的TeO2尺寸较大且分布不均；而随着温度的升高，液滴蒸发更快，合并概率小，生成的TeO2颗粒平均粒径更小且分布均匀。因此，通过控制不同的管式炉温度，可以有效控制合成的TeO2的粒径分布。[ a ][ b ][ c ][ d ][ e ][ f ][200 nm][200 nm][200 nm][200 nm][200 nm][200 nm]图3 不同温度合成的TeO2纳米颗粒的SEM图：（a） 400 ℃， （b） 500 ℃， （c） 600 ℃， （d） 700 ℃， （e） 800 ℃， （f） 900 ℃Fig. 3 SEM images of TeO2 nanoparticles synthesized at different temperatures：（a） 400 ℃， （b） 500 ℃， （c） 600 °C， （d） 700 °C， （e） 800 ℃， （f） 900 ℃2.2 TeO2纳米颗粒的抗菌活性2.2.1 TeO2纳米颗粒对MRSA 的MIC值 表1是不同粒径TeO2纳米颗粒的MIC值。由表1可知，不同温度下合成的TeO2纳米颗粒的抗菌活性存在差异，其MIC从512 μg/mL到8 μg/mL不等。相对于商用TeO2（粒径为1~5 μm），通过气溶胶法合成的所有TeO2纳米颗粒的MIC都更小，即具有更强的抗菌活性。其中，合成温度为400 ℃时合成的TeO2纳米颗粒的MIC最大，并且随着温度的升高所合成的TeO2的MIC逐渐减小，在900 ℃时到达最小，为8 μg/mL。且合成温度从700 ℃升高到800 ℃时，MIC从128 μg/mL降低到16 μg/mL，降低程度显著增大，这种变化趋势与TeO2粒径的变化趋势相一致。抗菌活性随颗粒粒径减小而增大的可能原因是更小的TeO2纳米颗粒，更容易进入细菌细胞，从内部发挥抗菌作用。相同作用也见于不同粒径的纳米银［22］、铜［23］等。表1 不同温度合成的抗MRSA TeO2纳米颗粒的MICTab. 1 MIC of TeO2 nanoparticles synthesized at different temperatures against MRSA [编号\&温度 / ℃\&平均粒径 / nm\&MIC / （μg/mL）\&T1\&400\&600\&512\&T2\&500\&450\&256\&T3\&600\&350\&256\&T4\&700\&250\&128\&T5\&800\&100\&16\&T6商用TeO2\&900\&301 000~5 000\&8>1 024\&]2.2.2 抗菌活性比较测试 为进一步评估所合成的TeO2抗MRSA的活性，比较了相同质量浓度下（32 μg/mL）900 ℃所合成的TeO2（T6）与合成前体H2TeO4、含碲化合物Na2TeO3、商用TeO2以及纳米银（32 和16 μg/mL）的抗MRSA活性，结果见图4。由图4可知，与空白对照相比，TeO2合成前体H2TeO4和商用TeO2几乎未表现出抗MRSA活性；含碲化合物Na2TeO3表现出了一定的抗菌活性，细菌数量从8.32 log CFU/mL（lg CFU/mL定义为每毫升样品中细菌菌落数的对数值）降到7.48 lg CFU/mL。T6具有较强的抗菌活性，使细菌数量从8.32 lg CFU/mL降到5.16 lg CFU/mL，低于同质量浓度的纳米银，而与浓度低一倍的纳米银相当。目前已报道的无机纳米抗菌剂中，纳米银的抗菌活性远高于其他抗菌剂，因此本文在900 ℃所合成的TeO2具有较高的抗菌活性。[ControlNa2TeO3H2TeO6TeO2T6AgNPs32AgNPs16][9876543210][lg（CFU/mL）]图4 TeO2纳米颗粒与其他抗菌剂对MRSA的抗菌活性Fig. 4 Antibacterial activities against MRSA of TeO2 nanoparticles and other antibacterial agents 3 结 论采用气溶胶法合成TeO2纳米颗粒，通过控制管式炉温度，可获得不同粒径的TeO2纳米颗粒。温度升高，粒径减小；400 ℃时平均粒径为600 nm，在900 ℃时平均粒径最小，为30 nm。TeO2纳米颗粒对MRSA的抗菌活性受到其粒径的影响，随着粒径的减小，其抗菌活性逐渐增强。在相同质量浓度下，30 nm粒径的TeO2纳米颗粒抗MRSA活性远高于前体H2TeO4、商用TeO2及Na2TeO3，与浓度低1倍的纳米银相当，表明所合成的TeO2纳米颗粒具有较高的抗耐药菌活性。并且相对于价格高昂的纳米银，气溶胶法合成的TeO2纳米颗粒粒径可控，成本低廉，方法简便，将是一种有前景的抗耐药菌药物。