研究发现，带胍基或脒基的类丝氨酸蛋白酶抑制剂能够有效的抑制胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶等酶的活性，一些蛋白酶抑制剂临床上已在急性胰腺炎的治疗上有所应用。甲磺酸加贝酯的药代动力学［8-9］是其进入人体后分解为6-胍基己酸和对羟基苯甲酸乙酯。本文中对其可能的作用基团进行修饰，测试并比较了这些基因对蛋白酶抑制作用的活性的不同。

在对甲磺酸加贝酯修饰过程中，采用生物电子等排原理［10-13］的设计原理。它们之间虽然有着部分类似的性质，但是在结构修饰后，它们的分子性质例如脂溶性或极性可能会发生彻底的变化，引起药物在人体代谢过程的改变［14-15］。因此，在药物设计之后需要大量的实验研究才能证实药物的安全有效性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

4-羟基-3-甲基苯甲酸、4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸、香草酸、丁香酸、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙酸酐、胰蛋白酶（Adamas公司）、Tris、L-BAPA（sigma公司）；浓盐酸、氢氧化钠、冰乙酸、氯化钙（以上试剂均为市售分析纯）。

LC-MS TOF型液质联用仪（美国安捷伦公司）；HGY05型400 MHz核磁共振谱仪（Bruker公司）；TU-1901型分光光度计（北京普析公司）；SB-4200DT型超声波清洗剂（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 甲磺酸加贝酯类似物的合成

1.2.1 化合物A的合成 将15.2 g （0.1 mol） 4-羟基-3-甲基苯甲酸溶于100 mL乙醇中，向溶液中加入5 mL浓硫酸，回流反应18 h，薄层色谱监控反应，反应结束后，旋除乙醇，向溶液中加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生。用20 mL乙酸乙酯萃取3次，再用水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，旋干，得到中间物（1） 4-羟基-3-甲基苯甲酸乙酯16.4 g，产率91.2%。

在圆底烧瓶中加入17.3 g（0.1 mol） 6-胍基己酸盐酸盐、21.6 g（0.12 mol） 4-羟基-3-甲基苯甲酸乙酯（1）和50 mL N，N-二甲基甲酰胺。搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，将残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到中间产物（2）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ ：1.71~1.79（t，3H，J =7.1Hz），1.79~1.91（m， 2H），1.96~2.05（m， 2H），2.06~2.19（m， 2H），2.98（s，3H），3.13~3.15 （t，2H，J = 7.0Hz ），3.47~3.57（m， 2H），4.67~4.81（q， 2H， J = 7.1Hz），7.66（s，1H），7.68（s， 2H），7.75~7.80（t， 1H， J =1.5Hz）。

将干燥后的（2）加入50 mL丙酮，加热至回流温度后滴加11.5 g （0.12 mol）甲磺酸，固体溶解后继续搅拌30 min，趁热过滤，将滤液放置冰箱冷却析晶，过滤，将滤饼真空干燥，得到白色晶体化合物A 36.1.g，产率83.6%（见图2）。

1.2.2 化合物B的合成 将16.6 g（0.1 mol） 4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸溶于100 mL乙醇中，向溶液中加入5 mL浓硫酸，回流反应18 h，薄层色谱监控反应，反应结束后，旋除乙醇，向溶液中加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生。用20 mL乙酸乙酯萃取3次，再用水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，旋干，得到中间物（3） 4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯17.5 g，产率90.5%。

在圆底烧瓶中加入17.3 g（0.1 mol） 6-胍基己酸盐酸盐，23.2 g（0.12 mol） 4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯（3）和50 mL四氢呋喃。搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到中间产物（4）。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ ： 1.33~1.40 （t， 3H， J = 6.5Hz），1.42~1.52（m， 2H），1.60~1.67（m， 2H），1.74~1.79（m， 2H），2.09~2.20（s， 6H），2.58~2.68 （m， 2H），4.23~4.35（q， 2H， J = 7.5Hz），7.70 （s， 1H），7.76（s， 2H）。

将干燥后的（4）加入50 mL丙酮，加热至回流温度后滴加11.5 g （0.12 mol）甲磺酸，固体溶解后继续搅拌30 min，趁热过滤，将滤液放置冰箱冷却析晶，过滤，将滤饼真空干燥，得到白色晶体化合物B 37.6 g，产率84.1%（见图3）。

1.2.3 化合物C的合成 将16.8 g（0.1 mol）香草酸溶于100 mL乙醇中，向溶液中加入5 mL浓硫酸，回流反应18 h，薄层色谱监控反应，反应结束后，旋除乙醇，向溶液中加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生。用20 mL乙酸乙酯萃取3次，再用水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，旋干，得到中间物（5）香草酸乙酯17.4 g，产率88.7%。

在圆底烧瓶中加入17.3 g（0.1 mol） 6-胍基己酸盐酸盐，23.5 g（0.12 mol）香草酸乙酯（5）和50 mL N，N-二甲基甲酰胺。搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到中间产物（6）。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ ： 1.73~1.79 （t， 3H， J = 7.1Hz），1.80~1.91（m， 2H），1.96~2.05（m， 2H），2.07~2.18（m， 2H），2.95~3.01（m， 3H），3.13~3.15（m， 2H），3.48~3.57（m， 2H），4.66~4.81（q， 2H， J = 6.9Hz），7.66 （s， 1H），7.68（s， 1H），7.82~8.00（m， 1H）。

将干燥后的（6）加入50 mL丙酮，加热至回流温度后滴加11.5 g （0.12 mol）甲磺酸，固体溶解后继续搅拌30 min，趁热过滤，将滤液放置冰箱冷却析晶，过滤，将滤饼真空干燥，得到白色晶体化合物C 36.8 g，产率82.4%（见图4）。

1.2.4 化合物D的合成 将19.8 g（0.1 mol）丁香酸溶于100 mL乙醇中，向溶液中加入5 mL浓硫酸，回流反应18 h，薄层色谱监控反应，反应结束后，旋除乙醇，向溶液中加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生。用20 mL乙酸乙酯萃取3次，再用水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，旋干，得到中间物（7）丁香酸乙酯16.7g，产率84.2%。

在圆底烧瓶中加入17.3 g（0.1 mol） 6-胍基己酸盐酸盐，23.5 g（0.12 mol）丁香酸乙酯（7）和50 mL N，N-二甲基甲酰胺。搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到中间产物（8）。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ ： 1.74~1.82 （t， 3H， J = 7.2 Hz），1.83~1.92（m， 2H），1.98~2.08（m， 2H），2.11~2.20（m， 2H），3.13~3.20（m， 2H），3.50~3.60（m， 2H），4.25（s， 6H），4.70~4.82（q， 2H，J = 7.0 Hz），7.70（s， 2H），7.73（s， 1H）。

将干燥后的（8）加入50 mL丙酮，加热至回流温度后滴加11.5 g （0.12 mol）甲磺酸，固体溶解后继续搅拌30 min，趁热过滤，将滤液放置冰箱冷却析晶，过滤，将滤饼真空干燥，得到白色晶体化合物D 40.7 g，产率84.9%（见图5）。

1.2.5 化合物E的合成 将19.8 g（0.1 mol）3，4-二羟基苯甲酸溶于100 mL乙醇中，向溶液中加入5 mL浓硫酸，回流反应18 h，薄层色谱监控反应，反应结束后，旋除乙醇，向溶液中加入饱和NaHCO3溶液直至无气泡产生。用20 mL乙酸乙酯萃取3次，再用水洗涤乙酸乙酯层，用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，旋干，得到中间物（9）3，4-二羟基苯甲酸乙酯15.2 g，产率90.5%。

在圆底烧瓶中加入17.3 g（0.1 mol） 6-胍基己酸盐酸盐，23.5 g（0.12 mol）3，4-二羟基苯甲酸乙酯（9）和50 mL N，N-二甲基甲酰胺。搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到中间产物（10）。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ ：1.33~1.39（t， 3H，J = 6.9 Hz），1.41~1.49（m， 2H），1.56~1.65（m， 2H），1.67~1.76（m， 2H），2.54~2.59（t， 2H），3.09~3.18（q， 2H， J = 6.5 Hz），4.29~4.38（q， 2H， J = 7.1 Hz），7.05~7.08（d， 1H， J = 6.7 Hz），7.56~7.68（m， 3H）。

将干燥后的（10）加入50 mL丙酮，加热至回流温度后滴加11.5 g （0.12 mol）甲磺酸，固体溶解后继续搅拌30 min，趁热过滤，将滤液放置冰箱冷却析晶，过滤，将滤饼真空干燥，得到白色晶体化合物E（35.6 g，产率82.1%）（见图6）。

1.2.6 化合物F的合成 将13.1 g（0.1 mol）6-氨基己酸和18 g（0.3 mol）尿素悬浮在50 mL DMSO中，在120 ℃下反应2 h，之后每隔30 min加入3 mL浓盐酸，待反应溶液澄清后再反应2 h，向溶液中加入30 mL浓盐酸，室温过夜，析出大量固体，过滤，用乙醇重结晶，得到白色固体，真空干燥，得到白色固体6-脲基己酸（11）。

把17.4 g（0.1 mol）6-脲基己酸（11）、19.9 g（0.12 mol）对羟基苯甲酸乙酯和50 mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，加入26.1 g（0.15 mol）三氟甲磺酸和20 mL吡啶，室温反应8 h。反应结束后，过滤，滤液减压除去N，N-二甲基甲酰胺和未反应完的吡啶。残余物加入50 mL水和50 mL三氯甲烷，充分搅拌之后分去水层，用15 mL水洗涤三氯甲烷层3次，将三氯甲烷蒸干，残余物加入50 mL水，搅拌下滴加100 mL饱和NaHCO3溶液，析出白色固体，过滤，真空干燥，得到化合物F 24.7 g，产率72.6%。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ ： 1.33~1.40 （t， 3H， J = 6.9 Hz），1.41~1.51（m， 2H），1.58~1.67（m， 2H），1.70~1.78（m， 2H），2.53~2.63（m， 2H），3.04~3.18（q， 2H， J = 7.4 Hz），4.32~4.41（q， 2H， J = 7.1 Hz），7.05~7.15（d， 2H， J = 0.4 Hz），7.58~7.60（m，1H），8.01~8.08（d， 2H， J = 2.2 Hz）（见图7）。

1.3 活性测试

1.3.1 溶液配制 （1） 6 mol/L盐酸溶液：取50 mL 12 mol/L浓盐酸加到50 mL水中，冷却至室温，定容到100 mL。（2） 1 mol/L盐酸溶液：取83 mL

12 mol/L浓盐酸加到500 mL水中，冷却至室温，定容到1 000 mL。（3） 0.1 mol/L盐酸溶液：取8.3 mL

12 mol/L浓盐酸加到500 mL水中，冷却至室温，定容到1 000 mL。（4） 0.001 mol/L盐酸溶液：取1 mL 1 mol/L盐酸（2）加到500 mL水中，冷却至室温，定容到1 000 mL。（5） 5.3 mol/L乙酸溶液：取30 mL冰乙酸加到50 mL水中，定容至100 mL。（6） 0.01 mol/L NaOH溶液：称取4.0 g NaOH，溶于500 mL水中，定容至1 000 mL。（7） CaCl2盐酸溶液：称取0.735 g CaCl2溶于1 L 0.001 mol/L盐酸溶液（4）中，调节pH = 3.0 ± 0.1。（8） 胰蛋白酶溶液：称取27.0 mg胰蛋白酶，用CaCl2盐酸溶液溶解（7），定容至100 mL。（9） 胰蛋白酶使用液：取5 mL胰蛋白酶溶液（8），用CaCl2盐酸溶液（7）稀释至100 mL。（10） Tris-CaCl2缓冲溶液：称取6.05 Tris和0.735 CaCl2溶于水中，用6 mol/L盐酸溶液（1）调节pH=（8.2±0.1），加水稀释定容至1 000 mL。（11） L-BAPA试剂：称取60 mg L-BAPA，用1 mL二甲亚砜溶解，用Tris-CaCl2缓冲溶液（10）稀释定容至100 mL。

1.3.2 样品制备 （1） 称取1.0 g甲磺酸加贝酯（或其类似物），加入50 mL 0.01 mol/L NaOH溶液（6），将试液充分搅拌，用1 mol/L盐酸溶液调节pH = 9.5 ± 0.1，放在冰箱中冷却15~24 h。（2） 将试液转移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，放入冰箱中冷却保存。（3） 在标准管和空白管中各加入1 mL胰蛋白酶使用液，用超声机将溶液混匀，将试管置于水浴中，保温10 min，在标准管中加入1 mL乙酸溶液，将其混匀。（4） 将标准管和空白管用离心机离心10 min。（5） 用分光光度计测定上清液的吸光度，在410 nm吸收处，以水调零。

1.3.3 活性测定 按照表1吸取一定量的溶液加入离心管中。

用超声机混匀各溶液，然后置于37 ℃水浴下控温10 min。

在上述溶液中各加入1 mL胰蛋白酶使用液（9），用超声机混匀后置于37 ℃水浴下控温10 min后将离心管离心10 min。用分光光度计测定上清液的吸光度，在410 nm吸收处用10 nm比色皿，用水调节零点，测定上清液的吸光度。

1.3.4 计算结果 （1）胰蛋白酶抑制百分比计算

将4个样品测得的吸光度带入下列公式得到样品抑制百分比。

[i=(Ar-Abr)-(As-Abs)(Ar-Abr)×100%]

其中，i为抑制百分比，Ar为标准溶液吸光度，Abr为空白标准溶液吸光度，As为样品溶液吸光度，Abs为空白样品溶液吸光度。

（2）胰蛋白酶抑制剂活性计算

将计算所得的抑制百分比i带入下列计算式得到胰蛋白酶抑制剂活性。

[TIA=i100%×m1f1f2m0]

其中，TIA为胰蛋白酶抑制剂活性（mg/g），m0为样品质量（g），m1为胰蛋白酶质量（mg），f1为样品的稀释度［100 mL×100 mL/F，F为理论稀释度，每100 g的体积（mL）］，f2为换算系数，2.8×10-4。

2 结果与讨论

2.1 测定结果

将甲磺酸加贝酯及其类似物按照以上方法进行测试，获得数据如表2所示。

表2 不同样品对TIA值的影响

Tab. 2 Effects of different samples on TIA values

[加入样品 吸光度 抑制百分比 / % TIA 空白样品 样品 A 0.415 3 0.247 4 55.37 1.16 B 0.470 8 0.315 7 58.77 1.23 C 0.373 5 0.218 2 58.72 1.23 D 0.397 1 0.234 7 56.83 1.19 E 0.287 2 0.112 6 53.59 1.13 F 0.363 3 0.153 6 44.26 0.93 ]

2.2 重复性测定

在相同实验室，由同一实验人员，在相同天气条件下，用相同实验方法对相同样品所做出的相同独立实验，测出TIA值。总实验次数为5次，将所得结果证明其重复性，结果如表3所示。

表3 重复性实验

Tab. 3 Repetitive experiment

[样品 TIA值 标准差 1 2 3 4 5 A 1.16 1.16 1.16 1.17 1.16 0.004 B 1.23 1.23 1.23 1.21 1.22 0.009 C 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 0.000 D 1.19 1.21 1.20 1.19 1.18 0.011 E 1.13 1.13 1.11 1.13 1.13 0.009 F 0.93 0.93 0.93 0.92 0.93 0.004 ]

由表3数据可以看出，甲磺酸加贝酯和甲磺酸加贝酯类似物对蛋白酶都有一定的抑制作用，抑制效果区别不明显，其中将胍基替换为脲基的化合物F的TIA值最低，由此猜测，该抑制蛋白酶的活性基团为胍基和酯基，虽然脲基与胍基有相似的生物活性，但脲基的作用效果不如胍基。因此，有望对该类型化合物进行进一步研究，合成更多结构类似的化合物，以寻找对胰蛋白酶抑制效果更优异的产品，能对治疗急性胰腺炎研发出更有效的药品。

3 结 论

急性胰腺炎的药物治疗一直是国际关注的热点，合成活性更高，更安全，效果更好的药物一直是研究热点。甲磺酸加贝酯的合成与应用已经趋于成熟，但对其类似物的研究仍处于空白。本文通过生物电子等排原理设计一系列化合物，寻找效果更优秀的化合物，为攻克急性胰腺炎寻找一条可行路径。对甲磺酸加贝酯和加贝酯类似物进行蛋白酶抑制活性研究，结果显示其均有一定的蛋白酶抑制活性，并且该实验有较高的重复性。猜测其对胰蛋白酶抑制作用基团为胍基和酯基，与胍基有类似生物活性的基团也有一定的效果，因此，对该基团进行进一步研究分析可能对胰蛋白酶的作用机理和急性胰腺炎的致病因素有更深入的理解，在该研究的基础之上能获得更广泛的研究。