1 实验部分
1.1 材料、试剂和仪器
1.1.1 材料与试剂 左旋紫草素标准对照品（武汉科建化玻教学设备有限公司，B50783），紫草（亳州市永刚饮片厂有限公司，210219），昆明小鼠［辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证：SCXK（辽）2020-0001］，小鼠RAW264.7巨噬细胞（武汉大学中国典型培养物保藏中心），色谱级甲醇（上海弗霓生物科技有限公司），娃哈哈矿泉水，噻唑蓝溶液（上海源叶生物科技有限公司），高糖培养基（Hyclone），磷酸盐缓冲液（Hyclone），双抗（Gibco），胎牛血清（Gibco），PGE2试剂盒（南京建成生物公司），NO、TNF-α、IL-6试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），二甲苯（上海国药控股有限公司）。
1.1.2 实验仪器 高校液相色谱仪（Waters e2695，美国沃特世公司），旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），分析天平（CP214，奥豪斯公司），真空干燥箱（DZF-6090，天津泰斯特仪器有限公司），循环水式真空泵（SHZ-D（Ⅲ），郑州市长城仪器有限公司）。
1.2 方 法
1.2.1 色谱条件 色谱柱为XBridge? C18柱（4.6?mm×150?mm，5?μm）；流动相A相为无水甲醇，流动相B相为水，A与B体积比为70∶30；流速：1?mL/min；检测波长：278?nm；柱温：35?℃；进样量：10?μL。
1.2.2 标准对照品储备液制备 用分析天平精密称取5.0?mg左旋紫草索标准对照品，加甲醇配制成500?μg/mL标准对照品储备液，摇匀，备用。
1.2.3 供试品溶液的配制 用分析天平精密称取0.1?g各组样品浸膏，用甲醇配制成10?mg/mL的供试品溶液，摇匀，备用。
1.2.4 线性关系考察 用1.1.2制备的母液分别配制质量浓度为100.000，50.000，25.000，12.500，6.250和3.125?μg/mL对照品溶液，滤膜过滤后按1.2.1所设色谱条件进样至高效液相色谱仪中，测定左旋紫草素峰面积。
1.2.5 方法学验证 方法学验证中各项测定均按1.2.1中所设色谱条件进行。
专属性试验：按1.2.3方法制备样品溶液，于微孔滤膜过滤后进样至高效液相色谱仪中，记录色谱图进行分析。
精密度试验：配制5、10、15 ?mg/mL的样品溶液，于微孔滤膜过滤后进样至高效液相色谱仪中，1?d内测定3次，测定左旋紫草素峰面积并计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，以考察仪器性能稳定性。
重复性试验：按1.2.3方法制备样品溶液，于微孔滤膜过滤后连续6针进样，测定左旋紫草素峰面积并计算其RSD值，以考察色谱条件是否具有重复性。
稳定性试验：按1.2.3方法制备样品溶液，于微孔滤膜过滤后取同一样品溶液分别于0、2、4、6、8和10?h进样，测定左旋紫草素峰面积并计算其RSD值，以考察仪器日内稳定性。
加样回收率试验：利用线性方程计算样品中所含左旋紫草素量，再加入相等质量的标准品，测定其峰面积及平均回收率并计算其RSD值。
1.2.6 正交试验设计 以药材粒径（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，以左旋紫草素含量为考察指标。每因素设置3个水平，采用L9（34）正交试验对紫草的提取工艺进行优选（表1）。
表1 因素水平
Tab. 1 Levels of factor
[因素
水平 A（药材类型） B（料液质量
体积比） /（g/mL） C（提取时间） / h 1 饮片 1∶（8~6） 2~1 2 最粗粉 1∶（10~8） 3~2 3 粗粉 1∶（12~10） 4~3 ]
1.2.7 最佳工艺验证实验 按最佳提取工艺进行 3 次平行实验，测量左旋紫草素含量，以验证优选的方法是否为最佳工艺。
1.2.8 细胞活性实验 按上述优选工艺提取新疆紫草中萘醌类成分，得到浸膏。称取一定量浸膏用高糖培养基配制成（0，10，20，40，60，80?μg/mL）的浸膏溶液。取一定量对数生长期的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）接种于96孔板中，置于CO2培养箱（37?℃，体积分数5% CO2），培养过夜，然后弃去原培养基并用不同浓度的浸膏溶液（0，10，20，40，60，80?μg/mL）孵育细胞 24?h，然后弃去原培养基并补加120?μL 高糖培养基（内含20?μL的噻唑蓝溶液），孵育4?h后吸去孔内培养液，加入150?μL二甲基亚砜于摇床上摇动10?min后用酶标仪（490?nm）检测吸光度。
1.2.9 脂多糖诱导细胞炎症实验 取一定量对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，设置空白组（Control）、模型组（Model）、新疆紫草中萘醌类成分低（L）、中（M）、高（H）剂量组（10，20，40 μg/mL），各组置于CO2培养箱（37?℃，体积分数5% CO2），培养过夜，然后弃去原培养基并用不同浓度的浸膏溶液（0，0，10，20，40?μg/mL）孵育细胞 4?h后，除空白组外各组加入脂多糖，使其终质量浓度为100?ng/mL，继续孵育16?h后，取其上清液，根据试剂盒说明书的方法检测上清液中PGE2、NO、TNF-ɑ、IL-6含量。
1.2.10 二甲苯致小鼠耳廓肿实验 将30只小鼠随机分成5组，即：空白组（Control）、新疆紫草中萘醌类成分低（L）、中（M）、高（H）剂量组（0.3，0.6，1.2?g/kg），阳性组（Positive，阿司匹林0.2?g/kg）。连续灌胃给药7 d，最后一次给药1?h后，除正常组外其余各组小鼠均在左耳耳廓均匀涂上20?μL二甲苯，致炎40?min后，将小鼠处死，沿耳廓基线剪下两耳，用打孔器分别于两耳对称位置打下圆形耳片，称取耳片重量并根据公式计算其肿胀度和抑制率：
肿胀度（g）＝左耳片重－右耳片重
抑制率（%）＝［（模型组肿胀度－给药组肿胀度）／模型组肿胀度］×100%
1.2.11 分子对接 将左旋紫草素与COX-2（PDB ID：6BL3）进行分子对接，对接软件使用SYBYL-X，对接模式为（surflex-dock Screen），力场选择（AMBER7 FF99），电荷选择（Gasteiger-Huckel）。
2 结果与讨论
2.1 实验结果
2.1.1 线性关系考察 标准对照品的线性回归方程为y=8 135.9x-6 889.0，线性范围为3.125~
100.000 μg/mL，R2为1，表明线性关系良好。
2.1.2 专属性试验 如图1所示，左旋紫草素峰型良好且与其他杂质峰达到基线分离，分离度大于 1.5，样品峰与标准品峰保留时间一致，表明该色谱条件专属性良好。
<G:\武汉工程大学\2023\第4期\刘明鑫-1.tif>[0 25.00 50.00
时间 / min][0.14
0.07
0][响应值 / AU][左旋
紫草素][样品溶液][对照品溶液]
图1 溶液液相色谱图
Fig. 1 Liquid chromatographic diagram of solution
2.1.3 精密度试验 结果显示，样品溶液中左旋紫草素的峰面积RSD值均小于2%，表明该仪器精密度良好（表2）。
表2 左旋紫草素的仪器精密度试验
Tab. 2 Instrument precision test on shikonin
[质量浓度 / (mg/mL) 质量含量 / (μg/mL) RSD值
5
35.5
34.5
34.8 1.47%
10
69.3
67.2
68.7 1.58%
15
102.4
103.1
103.9 1.30% ]
2.1.4 重复性试验 根据测得的峰面积结果，左旋紫草素质量浓度分别为63.1、59.6、64.5、60.9、58.7、59.9 μg/mL，计算得RSD值为3.66%，表明该仪器重复性良好，结果稳定性好且可信性度高。
2.1.5 稳定性试验 根据测得的峰面积结果，左旋紫草素质量浓度分别为72.0、72.8、72.9、74.7、73.4、75.6 μg/mL，计算其RSD值为1.82%，说明在10?h内样品溶液稳定性良好。
2.1.6 加样回收率试验 结果见表3，平均回收率为102.4%，RSD小于 3%，表明该法可以用于测定左旋紫草素的含量。
2.1.7 正交试验 根据正交因素表进行试验，高效液相色谱法检测左旋紫草素含量，结果及分析如表4~表5所示： 影响左旋紫草素含量的主次因素为 B＞A＞C，即料液比＞药材粒度＞提取时间，最佳工艺为 A2B2C2，即药材粒度选择最粗粉，第1次以1∶10的料液比提取3?h，第2次以1∶8的料液比提取2?h，根据表8的结果分析可知，3个因素均无显著性差异（p＞0.05），从节约成本和时间的角度考虑，采用最粗粉第1次以1∶8的料液比提取2?h，第2次以1∶6的料液比提取1?h为优选工艺。
表 5 结果分析
Tab. 5 Results analysis
[因素 离差平方和 自由度 均方 F值 p值 A
B
C
D 3.27
5.24
2.30
0.76 2
2
2
2 1.63
2.62
1.15
0.38 4.29
6.87
3.01
0.19
0.13
0.25
]
2.1.8 最佳工艺验证 根据所测得的峰面积结果，浸膏所含左旋紫草素量分别为8.6、8.8、8.5?mg/g，与正交实验结果相符，表明该工艺条件稳定可靠。
2.1.9 细胞毒性实验 结果见图2。不同浓度（10、20、40、80?μg/mL）的浸膏溶液孵育细胞24?h后，10、20、40?μg/mL 组的活性与空白组（0 μg/mL）比较均无显著性变化，但60、80?μg/mL 组与空白组相比其活性显著降低（*p <0.05），说明60、80?μg/mL对其产生了毒性作用，故选择40?μg/mL作为最大质量浓度进行实验。
2.1.10 脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症实验 由图3可知，模型组（Model）与空白组（Control）相比，100?ng/mL 脂多糖刺激可引起PGE2、NO生成量显著增加（##p<0.01），但新疆紫草中萘醌类成分可有效逆转该趋势（*p<0.05），且其作用与剂量呈正相关，浓度越高，作用越大。
<G:\武汉工程大学\2023\第4期\刘明鑫-3-1.tif><G:\武汉工程大学\2023\第4期\刘明鑫-3-2.tif>[Control Model L M H][1 000
800
600
400
200
0][PGE2质量含量 / （pg/g）][b][a][15
10
5
0][NO浓度 / （μmol/L）][Control Model L M H]
注： ##p < 0.01vs正常组，*p < 0.05、**p < 0.01vs模型组
图3 萘醌类成分对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症介质水平的影响：（a）PGE2质量含量，（b）NO浓度
Fig. 3 Effects of naphthoquinone components on levels of lipopolysaccharide-induced inflammatory mediators in RAW264.7 cells：（a） mass content of PGE2，
（b） concentration of NO
如图4所示，与空白组相比，在100?ng/mL 脂多糖刺激下，RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6的分泌量显著增加（##p < 0.01）。而新疆紫草中萘醌类成分处理后可以明显降低细胞中TNF-α、IL-6含量（*p < 0.05），表明其可以通过调控炎症因子的分泌来改善炎症。
2.1.11 二甲苯致小鼠耳廓肿实验 从小鼠耳廓肿实验结果可知：与模型组（Model）相比，新疆紫草中萘醌类成分对耳廓肿胀的抑制作用与剂量呈正相关，结果如表6和图5所示。
2.1.12 分子对接结果 对接打分Total score=7.442，根据公式Total score=lg1/Kd计算得，Kd=3.614×10-8，对接模式如图6所示，可见左旋紫草素能够与353位的丝氨酸，90位的组氨酸，355位的酪氨酸和349位的缬氨酸形成氢键，显示出了左旋紫草素与COX-2之间良好的亲和能力。而COX-2的表达增加与炎症有关，说明左旋紫草素的抗炎作用可能与抑制COX-2的活性有关。
2.2 讨 论
本研究基于优选的新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺参数，进一步优选其最佳提取工艺而设计的研究内容。药材的粒度、料液比及提取时间对药材的提取都有很大的影响［12］，因此，筛选出最佳提取工艺参数是药材提取的非常重要的内容及过程。本研究利用正交试验对3种工艺参数（药材的粒度、料液比及提取时间）进行筛选，选出了最佳的提取工艺：即药材粒度选择最粗粉，第1次以1∶10的料液比提取3?h，第2次以1∶8的料液比提取2?h，但不同料液比及提取时间对左旋紫草素含量没有显著差异，故为了节约时间和成本，将最粗粉第1次以1∶8的料液比提取2?h，第2次以1∶6的料液比提取1?h作为优选工艺。体外巨噬细胞炎症模型和体内动物模型实验表明了新疆紫草中萘醌类成分能够下调炎症介质PGE2，NO和炎症细胞因子IL-1β，TNF-α的表达，抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，具有一定的抗炎作用。花生四烯酸在环氧化酶（cyclooxygenase，COX）的作用下生成PG，PG在脂氧化酶的作用下生成白三烯（leukotriene ，LT）。LT是炎症反应中重要的炎性介质，可引起毛细血管通透性增加，血浆外渗［13］，从而引起急性渗出性炎性水肿，参与炎症形成及与其他炎症介质有协同作用［14］。Kemp等［15］发现白三烯抑制剂扎鲁司特可明显抑制哮喘患者接触抗原后TNF-α及组胺水平的升高。左旋紫草素与COX-2具有良好的亲和能力，能与COX-2结合，抑制其活性，从而抑制PG、LT等炎症介质的生成，减轻炎症反应。NO常参与机体的免疫应答，但其过度表达会导致炎症级联反应，引起炎症，造成机体的严重损伤［16］，同时，TNF-α还可激活炎症相关通路NF-κB，引起IL-1β、IL-6等炎症因子的增多和炎症介质NO的释放，加重炎症反应。新疆紫草中萘醌类成分能下调NO，IL-1β，TNF-α的表达，缓解其引起的炎症反应。
3 结 论
由上述实验可知，新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺优选为：采用最粗粉第1次以1∶8的料液比提取2?h，第2次以1∶6的料液比提取1?h，该工艺稳定可靠，体外和体内实验证明其具有较好的抗炎药效，且其抗炎机制可能与抑制COX-2的活性有关。