我国磷矿总量虽然位居世界第二，但多数品位不高［4-6］，中低品位磷矿占到80%以上，这些磷矿难以分选和加工而成为高浓度磷肥或复肥［7］。我国中低品位磷矿的利用主要有选矿法、湿法、热法、微生物法等［8-12］。其中，传统的化学方法对设备、技术水平要求较高，且工艺大都较为复杂，易造成严重的污染问题［13］。与化学方法相比，微生物浸矿具有对环境友好、易操作成本低等特点［14］。解磷微生物能够通过分泌有机酸、质子交换、酶解作用等机制将难溶性的磷转为可溶性的磷［15］，因此解磷微生物能够充分利用中低品位磷矿，避免资源的浪费，缓解精矿缺乏的难题［16］。

20世纪90年代，我国就开始使用具有解磷能力的菌剂，目前关于解磷微生物的研究包括有解磷微生物对难溶性磷的分解能力、机理及应用等 ［17-19］。除了对环境友好、节约矿产资源之外，将解磷菌及磷矿粉施入土壤，能够增加土壤中的磷素［20-22］。同时可以增产作物提高作物抗逆性，固定土壤重金属等 ［23-25］。

但迄今为止大多数研究都针对单一菌种，对复合菌的研究较少。微生物之间具有多种相互作用如协同、竞争、拮抗和寄生等，在复合菌中一种菌株的代谢产物或可作为其他菌株的能源物质相互促进生长，多种菌株共同作用能够促进污染物降解［26］，相比于单菌，复合菌功能更加稳定高效［27］。基于上述背景，本研究选用了4株解磷菌进行组合，筛选出解磷效果最佳的复合菌，并对该复合菌分解磷矿粉的条件进行了优化。为复合菌在高效分解磷矿粉的应用提供了参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 低品位磷矿 磷矿粉：实验中所用低品位磷矿粉为来自湖北省宜昌市，将磷矿石磨碎过筛后取粒径为0.074~0.150 mm之间的磷矿粉作为实验磷矿粉。低品位磷矿组成如表1所示。

1.1.2 实验菌株 实验菌株为本实验室从湖北省宜昌某磷矿废弃地中筛选的解磷菌株，分别为假单胞菌LA（Pseudomonas LA），棘孢木霉 LZ1（Trichoderma aculeatus LZ1），巨大芽孢杆菌EC3（Bacillus megaterium EC3），沙雷氏菌LX1（Serratia LX1）。为方便后续实验，依次编号为A、B、C、D。

1.1.3 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。PKO培养基：葡萄糖 10.0 g，酵母浸粉 0.5 g， （NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2 1.0 g， FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。磷矿粉培养基：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4?7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，FeSO4?7H2O 0.03 g，磷矿粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 解磷复合菌筛选 将假单胞菌LA（Pseudomonas LA），棘孢木霉LZ1（Trichoderma aculeatus LZ1），巨大芽孢杆菌EC3（Bacillus megaterium EC3），沙雷氏菌LX1（Serratia LX1），分别在LB培养基内培养至对数期，按照表2复合菌株组合方案，取菌液总量为4 mL，各菌株间菌液体积比为1∶1，接入至含50 mL PKO培养液的锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温摇床中，30 ℃、165 r/min培养7 d，在第3、5、7 d取样测量pH、可溶磷质量浓度，重复3次。

表2 菌株的组合方案

Tab. 2 Schemes of strain’s combination

[编号 组合方案 编号 组合方案 1 CK 9 BC 2 A 10 BD 3 B 11 CD 4 C 12 ABC 5 D 13 ABD 6 AB 14 BCD 7 AC 15 ACD 8 AD 16 ABCD ]

1.2.2 不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果的影响 组合方式：?先培养后组合：将各菌株先在不同LB培养基中分别培养至对数期，再各取1 mL菌液进行混合，接入含50 mL PKO培养基的锥形瓶中培养；?先组合再培养：将各菌株接入同一LB培养基培养至对数期，再取等量混合培养菌液至含50 mL PKO培养基的锥形瓶中培养。选取3组解磷效果最好的解磷复合菌进行上述实验， 30 ℃、165 r/min培养7 d，每天取样测量可溶磷质量浓度。

1.2.3 碳源和氮源对复合菌解磷效果的影响 以PKO培养基为基础，选取解磷效果最佳的复合菌，控制单一变量，分别在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和果糖）和不同氮源（尿素、硫酸铵、氯化铵和蛋白胨）条件下，将筛选出的最佳解磷复合菌于30 ℃、165 r/min恒温摇床中培养7 d，测定可溶磷质量浓度。

1.2.4 复合菌分解低品位磷矿的条件优化 单因素实验：以解磷效果最佳的复合菌进行实验，在不同接种量（4%、10%、15%、20%和25%）、初始pH（5、6、7、8和9）、碳源质量浓度（0、5、10、15和20 g/L）和氮源质量浓度（0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 g/L）条件下，于30 ℃，165 r/min将解磷复合菌在磷矿粉培养基种培养7天，测定可溶磷质量浓度。正交实验：根据单因素实验结果，选取对复合菌解磷影响较大的因素设计正交实验，具体见表3。

表3 复合菌解磷条件优化正交实验设计

Tab. 3 Orthogonal experimental design for optimization of phosphate solubilizing conditions by complex bacteria

[实验

序号 影响因素 接种量 / % pH 碳源质量浓度

/ （g/L） 氮源质量浓度

/ （g/L） 1 4 5 5 0.3 2 10 7 10 0.4 3 15 9 15 0.5 ]

1.3 测试方法

用梅特勒Seven Compact pH计S210测量待测样的pH值；利用钒钼酸铵比色法检测可溶磷质量浓度；用Excel 2019、SPSS 18.0和Origin 2019进行了数据分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 解磷复合菌筛选

由表4可知，复合菌AB、AC和ABC在第5 d的适合可溶磷质量浓度分别为354.30、397.86和347.51 mg/L，均高于单菌，菌株ABC间具有良好的协同作用。同时，复合菌的解磷效果并不都优于单菌株。菌株D与菌株ABC复合时，可溶磷质量浓度均低于单菌，表现出强的拮抗作用。由此并不是组合内的菌株越多，解磷效果就越好 ［28］，这与菌株间的相互作用有关，需要进一步研究。

利用相关分析发现可溶磷质量浓度和pH之间呈显著负相关（r=-0.840，p<0.01）。菌液中的pH值越低，解磷效果相对越好。通过分泌有机酸来分解难溶性磷酸盐是解磷微生物的主要解磷途径之一，这与秦利均等［29］的研究结果一致，分解程度与酸度密切相关，即菌株产酸能力越强，酸度越大，可溶磷质量浓度越高，反之越低。

2.2 不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果的影响

从图1中可以看出，先培养后组合解磷效果明显优于先组合后培养（p<0.01）。图1（a）中，复合菌AB以方式①进行复合，可溶磷质量浓度最高达到263.05 mg/L；以方式②进行复合，可溶磷质量浓度最高为248.03 mg/L；且在相同培养时间内，方式①的可溶磷质量浓度均高于方式②。图1（b）中，复合菌ABC以方式①进行复合，其可溶磷质量浓度最高达到276.74 mg/L；以方式②进行复合，可溶磷质量浓度最高为160.52 mg/L。图1（c）中，复合菌AC以方式①进行复合，可溶磷质量浓度最高达到360.53 mg/L；以方式②进行复合，可溶磷质量浓度为327.89 mg/L；且在相同培养时间内，按方式①组合的复合菌的可溶磷质量浓度均高于方式②。这可能是因为菌株在营养充足的条件下单独培养至对数期，再接入解磷培养基，此时各菌株的生长状态较好［30］，各菌株的接种比例较易控制，接种量相对平衡，解磷效果较好。将各菌株先共同培养，各菌株的接种量难以控制，且可能会因为在生长初期竞争营养成分，各菌株生长情况不稳定，解磷效果相对较差。同时研究发现，复合菌AC的解磷效果最好，且效果稳定。结合表4，后续实验以复合菌AC为研究对象。

2.3 碳源和氮源对解磷复合菌溶磷效果的影响

由图2（a）可知，当以蔗糖为碳源时，复合菌AC的解磷效果最佳，培养液中可溶磷质量浓度为355.63 mg/L。其次是以葡萄糖为碳源时，培养液中可溶磷质量浓度为341.94 mg/L。以可溶性淀粉和果糖为碳源时，复合菌AC仍有一定的解磷效果，培养液中可溶磷质量浓度分别为246.15 和229.97 mg/L。以蔗糖和葡萄糖为碳源时，其溶磷效果差异不显著，但考虑到蔗糖价格低于葡萄糖，选用蔗糖为复合菌AC的碳源。

由图2（b）可知，当以硫酸铵和蛋白胨为氮源时，培养液中可溶磷质量浓度分别为338.13 和329.05 mg/L，差异不显著。以氯化铵和尿素为氮源时，复合菌AC的解磷效果不佳，培养液中可溶磷质量浓度分别为260.76 和161.42 mg/L。可能是因为氯离子对微生物的有一定的毒性 ［31］，且复合菌AC对尿素的利用率不高。综合成本考虑，选用硫酸铵作为复合菌AC的氮源。

2.3 复合菌分解低品位磷矿的条件优化

2.3.1 单因素实验结果 单因素实验结果表明，接种量、初始pH、碳源质量浓度及氮源质量浓度对复合菌AC解磷效果均有影响。如图3（a）所示，随着接种量的增加，培养液中可溶磷质量浓度先增大后减少，在接种量为10%时，解磷效果最佳，可溶磷质量浓度为359.37 mg/L。这可能是菌株的接种量较大时，更早到达稳定期，从而消耗培养液中的可溶磷，导致可溶磷质量浓度的降低。如图3（b）所示，可溶磷质量浓度随着pH的增加而减少，pH越低，解磷效果越好。在培养液初始值为5时，解磷效果最佳，为315.93 mg/L。如图3（c）所示，随着碳源质量浓度的增加，培养液中可溶磷质量浓度先增加后减小，在碳源质量浓度为10~15 g/L时，解磷效果较好，最高为329.92 mg/L。这可能是适量的碳源质量浓度对微生物的生长有促进作用，过高的碳源可能会对微生物的生长产生抑制 ［32］。如图3（d）所示，随着氮源（硫酸铵）质量浓度的增加，可溶磷质量浓度先增加后减小，在氮源质量浓度为0.5 g/L时，解磷效果最佳，可溶磷质量浓度为347.37 mg/L。氮源质量浓度过高，会导致培养液中的游离氨浓度升高，从而抑制菌株活性［33］；而过低又无法提供充足的生长条件。因此，需要选择适量的氮源质量浓度。

2.3.2 正交实验结果 为了优化复合菌株AC分解磷矿粉的最佳条件，根据以上单因素实验，结合正交实验，所得结果如表5。可以看出对可溶磷质量浓度的影响顺序为：接种量>碳源质量浓度>氮源质量浓度>初始pH，其中最优方案组合为复合菌AC的接种量（10%）、碳源质量浓度（10 g/L）、氮源质量浓度（0.5 g/L）、初始pH 5。

3 结 论

（1）复合菌AB、AC和ABC在第5 d的可溶磷质量浓度达到最高，分别为354.30、397.86和347.51 mg/L，均高于单菌，菌株ABC间具有良好的协同作用。复合菌的解磷效果并不都优于单菌株。菌株D与菌株ABC复合时，其可溶磷质量浓度均低于单菌，表现出强的拮抗作用。菌株的解磷能力与菌株的产酸能力显著相关。

（2）不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果有显著影响。以先培养后组合的方式组合的复合菌解磷效果明显优于以先组合再培养的复合菌解磷效果。复合菌AC解磷效果最佳，且解磷效果最稳定。

（3）筛选出了解磷效果最佳且最稳定的复合菌株AC，即假单胞菌LA （Pseudomonas LA），巨大芽孢杆菌EC3 （Bacillus megaterium EC3）。该组复合菌株在第5 d可溶磷质量浓度可达397.86 mg/L，后续实验表明其解磷效果稳定。同时，复合菌AC的最适碳源和氮源分别为蔗糖和硫酸铵。

（4）单因素实验表明初始接种量、初始pH、碳源质量浓度和氮源质量浓度对复合菌AC解磷效果有显著影响。综合正交试验分析发现，影响复合菌AC解磷效果的影响因子主次顺序为：接种量 >碳源质量浓度>氮源质量浓度>初始pH，复合菌分解低品位磷矿的最优条件为：复合菌接种量10%、蔗糖质量浓度10 g/L、硫酸铵质量浓度0.5 g/L、初始pH 5。