化合物毒性是评估其生态风险的重要依据［2， 15］。研究表明27-BCZ能诱导显著的类二噁英毒性机制的发育毒性，比如引起斑马鱼心胞水肿、卵黄囊胀大的心脏发育异常［16］。通过人脐静脉内皮细胞实验，人们发现27-BCZ通过增强表达血管生成素2 （Ang2），诱发血管发育毒性［17］。Ji等［18］发现27-BCZ能够显著干扰小鼠肝脏代谢功能，引起糖代谢紊乱，显著提高血液碱性磷酸酶水平，引发肝脏毒性效应。目前，人们对27-BCZ致肝毒性的作用机理并不明确。

肝脏是重要的代谢和解毒器官，明确环境污染物对肝脏的危害及机制，有助于准确地评估其风险，制定有效的管理对策。不同于药物作用机制的研究具有一定的目标性，环境中污染物毒性机制研究没有明确的靶标，研究过程广泛而复杂。随着现代网络技术的发展和毒性数据集的丰富，网络毒理学应运而生。网络毒理学借助现代数据库集和智能计算筛选手段，通过构建网络模型来预测目标化合物的毒性作用靶点和信号通路［19-21］。一定程度上缩小化合物毒性作用机制研究范围。基于此，本研究将利用网络毒理学方法结合斑马鱼暴露实验，研究环境有机污染物27-BCZ导致肝脏损伤的分子机制，为明确27-BCZ的生态风险提供基础依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

27-BCZ （CAS：136630-39-2，纯度≥ 98%）、二甲基亚砜、生物染料苏木精（CAS：517-28-2）和伊红（CAS：15086-94-9）以及其他溶剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）购自上海碧云天生物技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；RNA提取Trizol试剂、反转录试剂盒（PrimeScriptTM

RT reagent Kit， No.RR047A）和荧光定量试剂盒（TB GreenR Premix EX TaqTM， No.RR420A）购自宝日医生物技术有限公司。仪器包括电子天平（ME102，梅特勒）、离心机（Gentrifuge5424R，德国Eppenderf）、荧光定量RT-qPCR仪（LightCycler 480II，瑞士Roche）、显微镜（Cover-015，日本OLYMPUS）、多功能酶标仪（SpcctraMaxiD3，美国Molecular Devices）等。

1.2 27-BCZ对斑马鱼的暴露实验

野生型AB系斑马鱼购自中国科学院水生生物研究所，在时间比（以小时计）14∶10光暗循环和（27±1）℃水温的条件下适应性饲养2周以上。每天按照斑马鱼质量分数2%~3%的比例投喂鱼用饲料，每天更换一半暴露液并清除食物残渣和粪便。适应期结束后，将斑马鱼随机分为3组，每组3个平行，每个平行60条鱼，养殖体积20 L。依据斑马鱼胚胎96 h半致死效应浓度［LC50=（1.79±0.09） μmol/L］［11］，设置浓度为0 μmol/L（溶剂空白对照）、0.05 μmol/L和0.15 μmol/L 3种27-BCZ暴露组，采用半静态暴露法共暴露培养24 d。

1.3 27-BCZ对斑马鱼肝功能和组织损伤分析

暴露结束后，收集各组肝组织样本并称重，一部分肝脏样品加入9倍的生理盐水匀浆肝组织。将匀浆液4 ℃ 2 500×g离心10 min；取上清液，采用蛋白试剂盒测定蛋白浓度；并参照相应试剂盒说明书检测斑马鱼肝脏功能AST和ALT活性，明确27-BCZ暴露后斑马鱼肝脏功能状况。一部分肝脏在质量分数4%多聚甲醛中固定24 h，将固定的组织块脱水、包埋、切片；随后将切片脱蜡，依次用苏木精和伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，再水化，并用中性树胶封片；在光学显微镜下观察各组肝脏的组织病理学变化［22］。

1.4 网络毒理学预测27-BCZ致肝损伤的潜在靶点

27-BCZ的3D结构图从Pub Chem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取，并保存为sdf格式，将其导入Pharm Mapper数据库（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）获取潜在靶点信息［23］。根据相似匹配原则，筛出潜在目标靶点，导入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）获取靶点标准化基因名称。以“Liver injury”为关键词在CTD数据库（https：//ctdbase.org/）和Gene Cards （https：//www.genecards.org/）检索与肝损伤相关的作用靶标［24］，结果导入UniProt数据库，获取肝损伤靶点标准基因名称。将交集靶标导入蛋白质互作数据库（https：//string-db.org/），利用Cytoscape 3.10.2构建蛋白互作网络，根据Degree值（基因的连接数）筛选出27-BCZ致肝损伤关键靶点［25］。

1.5 27-BCZ致肝损伤的GO和KEGG富集分析

将上述所得的关键靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行相关基因的基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。将得到的数据结果按照P值从小到大排序（P < 0.05），根据排序结果筛选出前8个GO分析条目和前20条KEGG富集通路并分析［26］。

1.6 核心靶点分子对接

根据Degree值筛选27-BCZ诱导肝损伤排名前5的核心靶点，以27-BCZ作为配体，核心靶点为受体蛋白，进行分子对接。分别在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取27-BCZ及核心靶点的3D结构，利用Pymol 2.5.7软件将配体和受体去水、去配体、加氢后，导入AutoDockTools 1.5.7进行对接，结果使用Pymol 2.5.7软件可视化展示［27］。

1.7 致肝损伤的PI3K-Akt信号通路基因检测验证

基于网络毒理学方法分析，发现PI3K-Akt信号通路和细胞凋亡机制是27-BCZ致斑马鱼肝细胞损伤的潜在原因。为进一步验证分析结果，本研究将通过RT-qPCR分析路径相关基因（pi3k、akt、bcl-2、bax和caspase 3）的表达水平［27］。每5只斑马鱼肝脏作为一个平行，每组3个平行，每个平行样品加入1 mL Trizol试剂进行组织匀浆。匀浆液使用氯仿提取后11 000 g，4 ℃离心18 min，上清液收集后加入等体积异丙醇沉淀RNA。沉淀通过12 000 g，4 ℃离心10 min收集，质量分数75%乙醇3次清洗后，冷冻干燥并复溶到50 μL无酶超纯水中。通过测定OD260/280值，评估RNA提取的纯度是否合格，根据合格的纯度数据设计反转录实验样品用量，然后RT-qPCR检测转录基因的表达量。实验条件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s （40个循环）［28］。目标基因mRNA表达水平与管家基因gapdh进行标准化后，结果用2-ΔΔCT计算值表示。基因的登录号（genbank accession number）和引物列于表1［29］。

1.8 统计分析

应用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计量资料以均值和标准偏差表示。将各组数据进行正态分布检验和方差齐性检验，方差齐性检验采用Levene Statistic方法，若服从正态分布，两组之间比较采用student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若不符合正态分布，则采用非参数检验。不同英文字母（a、b和c）间存在显著性差异（P < 0.01），P < 0.05为差异有统计学意义。*表示显著性水平，*P < 0.01，**P < 0.001。

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼肝损伤的病理观察和生理参数分析

组织病理学HE染色结果表明，空白对照组斑马鱼肝脏的肝细胞质均匀，肝细胞沿细胞索规则排列，细胞核呈规则圆形位于细胞中央［图1（a）］。与空白对照组相比，0.05和0.15 μmol/L 27-BCZ暴露组斑马鱼肝脏部分区域出现单个细胞溶解，胞核固缩变形并位于细胞边缘，胞核溶解，肝索排列稀疏且轻度紊乱［图1（b，c）］。使用Image J对多张平行处理的HE染色切片（最大400倍）定量分析，可得对照组、0.05 μmol/L组和0.15 μmol/L组的细胞核面积占总细胞面积百分比分别为（15.454±2.080）%、（13.926±1.410）%和（10.251±1.390）% ［图1（d）］。这些结果表明27-BCZ暴露可造成一定剂量依赖性的肝损伤或肝毒性。

0.05和0.15 μmol/L 27-BCZ均可显著引起斑马鱼肝脏ALT和AST水平升高［图1（e，f），P < 0.01］，表明27-BCZ暴露所造成的损伤，会对肝脏的正常生理过程产生一定的影响。

2.2 27-BCZ致肝损伤潜在作用靶点预测

网络毒理学方法应用于探究27-BCZ致肝损伤的靶点机制。通过Pharm Mapper数据库共得到27-BCZ的潜在靶点302个，通过“Liver injury”为关键词在CTD和Gene Cards数据库得到与肝损伤相关的靶点共1 884个，取交集获得27-BCZ靶标与肝损伤相关的交集靶点149个。将交集靶点导入Cytoscape软件，得到“27-BCZ-Liver injury-靶点”互作网络拓扑分析图（图2）。多靶点错综复杂的网络结构，说明27-BCZ导致肝损伤是多靶点共同作用的结果。

2.3 27-BCZ诱导肝损伤靶点的GO分析和KEGG通路富集分析

在GO分析中，共得到生物过程（biological process，BP） 54条，主要涉及磷酸化（phosphorylation）、DNA的转录调控（regulation of transcription，DNA-templated）、细胞分化（cell differentiation）等［图3（a）］；细胞成分（cellular component，CC）共富集到12条，主要包括细胞核（nucleus）、胞质（cytosol）、受体复合物（receptor complex）等；分子功能（molecular function，MF）共富集42条，主要涉及转移酶活性（transferase activity）、DNA结合（ATP binding）、核苷酸结合（nucleotide binding）等。

KEGG富集分析共得到相关代谢通路78条，将P值最小前20条通路排序［图3（b）］，结果表明PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）等为27-BCZ导致肝损伤的主要信号通路。

2.4 27-BCZ致肝损伤靶点蛋白互作网络分析

将149个交集靶点导入String数据库，最低相互作用阈值设置为0.70，进行蛋白互作网络分析。结果总共包括149个节点和344条边，平均节点度值为4.62。Cytoscape软件将中心核心的30个靶点结果可视化（图4）：椭圆节点表示蛋白靶点，边表示蛋白间关联，节点颜色深浅与度值（Degree）呈正相关。Degree愈大，评分愈高，靶点的作用愈关键。Degree评分较高的核心靶点包括丝裂原活化蛋白激酶1 （mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、热休克蛋白90α型1 （heat shock protein 90kDa alpha （cytosolic）， class A member 1，HSP90AA1）、热休克蛋白90β型1 （heat shock protein 90kDa alpha （cytosolic）， class B member 1，HSP90AB1）、维甲酸X受体α （retinoid X receptor α，RXRα）、核受体共激活因子1 （nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）等，是27-BCZ导致肝损伤的潜在核心靶点。

上述5个核心靶点均与PI3K-Akt信号通路有关［30-32］，这一结果与KEGG信号通路富集分析结果一致，表明PI3K-Akt信号通路在27-BCZ致肝损伤中具有潜在重要作用。关键靶点中MAPK1又称细胞外调节蛋白激酶（ERK2），参与细胞生理和病理的调节，ERK2缺乏会改变ERK信号通路，减轻肝纤维化和炎症反应［33］。HSP90AA1和HSP90AB1是HSP90基因家族的一部分，在包括AKT在内的许多蛋白的稳定性中起着至关重要的作用［34］。NCOA1可诱导对转录激活至关重要的类固醇受体（核受体）的结构变化，NCOA1过表达可抑制氧化应激和激活PI3K-Akt通路，从而减轻内皮损伤［32］。RXRα是一类配体依赖型转录因子，是核配体激活的转录因子家族的成员，RXRα过表达会导致AKT磷酸化，通过影响PI3K-Akt通路发挥作用［35］。PI3K-Akt信号通路在细胞代谢、生长和凋亡中起着重要作用，PI3K-Akt通路参与众多肝脏损伤的病理变化，下调PI3K-Akt信号通路可激活线粒体膜凋亡，从而导致肝损伤［29， 36］。

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图4 27-BCZ致肝损伤的靶点蛋白互作分析

Fig. 4 Protein-protein target interaction network of liver

injury induced by 27-BCZ

2.5 分子对接

进一步将前5个核心靶点与27-BCZ分别进行分子对接。结合能< -4.0 kcal·mol-1表示配体和靶点蛋白有较好的结合活性，< -7.0 kcal·mol-1表示配体和靶点蛋白有强的结合活性［37］。发现27-BCZ与5个核心靶点的结合能均小于-5.0 kcal·mol-1，表明27-BCZ与5个核心靶点均能稳定结合（表2）。其中RXRα与27-BCZ结合活性最高，结合能为-7.31 kcal·mol-1，表明27-BCZ能与RXRα蛋白强结合。27-BCZ与核心靶点RXRα分子对接的最优结合模式（图5），显示27-BCZ很好结合到RARα蛋白口袋，27-BCZ的氮原子与口袋中的支链B的SER-420 （B）氨基残基形成长度为0.286 nm的氢键［图5（b）和（c）］。2D图显示27-BCZ与RXRα结合除了氢键作用，还与RXRα的A和B链上的Phe438 （A）、Leu441 （A）、Glu434 （A）、Arg427 （B）、Phe424 （B）等残基有疏水相互作用［图5（d）］。分子对接结果显示，27-BCZ可能通过与RXRα结合，介导PI3K-Akt信号通路，诱发肝损伤。

表 2 27-BCZ与核心靶点的对接结果

Tab. 2 Docking results between 27-BCZ and core targets

[靶点 Uniprot ID PDB ID 结合能 / (kcal/mol) HSP90AA1 A5A6K9 2UWD -5.70 HSP90AB1 P08238 3NMQ -5.76 RXRα P19793 3FC6 -7.31 NCOA1 Q15788 5NWX -6.38 MAPK1 O94737 1PME -6.61 ]

<G:\武汉工程大学\2024\第5期\张巧云-5.tif>[（b）][（a）][27-BCZ][Br][Br][HN][RXRα][（d）][（c）][ASP-442][ASP-273][PHE-424][氢键][SER-420][LEU-441][2.86][PHE-438][GLU-421][GLU-434][Arg427（B）][Phe424（B）][Br2][C12][C10][Leu441（A）][C6][C4][C8][C2][C1][C5][C11][C9][C3][C7][N][2.86][C][O][CA][CB][OG][N][Br1][Phe438（A）][Glu434（A）][Ser420（B）]

注：27-BCZ的氮原子与SER-420 （B）氨基残基形成长度为0.286 nm的氢键。

图5 27-BCZ与靶点蛋白RXRα的分子对接

Fig. 5 Docking views of 27-BCZ and RXRα

2.6 关键基因表达定量分析

为进一步探讨27-BCZ致肝损伤的分子过程和验证网络毒理学方法分析预测27-BCZ致肝损伤机制的可行性，基于对PI3K-Akt信号通路及其介导的凋亡路径的分析，筛选5个相关关键基因pi3k （负责编码细胞内信号传递和代谢的重要酶）、akt （编码一种丝氨酸特异性蛋白激酶）、bcl-2 （B细胞淋巴瘤-2基因）、bax （编码Bcl-2相关X蛋白）和caspase 3 （编码半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶），检测关键基因在0.05 μmol/L和0.15 μmol/L 27-BCZ暴露组斑马鱼肝脏内的表达水平。发现PI3K-Akt信号通路及其介导的凋亡路径的pi3k、akt和bcl-2转录水平显著降低（P<0.001），bax和caspase 3转录水平显著升高（P<0.001），而且这种降低或升高的趋势随着暴露浓度的升高得到进一步的增强（图6）。PI3K-Akt信号通路是一种经典的信号转导通路［29， 38］，pi3k和akt的转录异常，进一步介导其下游靶标如bax和bcl-2的基因及其相关蛋白的表达，参与细胞凋亡［39］。细胞凋亡的特征是DNA断裂、细胞收缩和Bcl-2家族激活［40］；关键步骤是细胞色素c从线粒体释放，促进凋亡小体产生和caspase 9激活，进而激活caspase 3，促进细胞凋亡的进一步扩大，在组织损伤或病理中起重要作用［41］。

这些基因的异常表达表明27-BCZ诱导肝损伤与PI3K-Akt信号通路介导的细胞凋亡有关，这一结论与3，6-二氯咔唑（另一典型PHCZ单体）诱导黄颡鱼肝损伤的分子机制一致［27］，表明网络毒理学方法用于环境有机污染物毒性机制预测，具有一定可靠性。

<G:\武汉工程大学\2024\第5期\张巧云-6.tif>[pi3k akt bcl-2 bax caspase 3][2.0

1.5

1.0

0.5

0.0][mRNA相对表达量][空白组 0.05 μmol/L 0.15 μmol/L ][*][*][*][*][*][*][*][*]

图6 PI3K-Akt介导细胞凋亡部分关键基因的mRNA表达水平

Fig. 6 mRNA expressions of genes related to PI3K-Akt

mediated apoptosis

3 结 论

卤代咔唑27-BCZ暴露引起斑马鱼肝脏损伤，出现核固缩、溶解变性等病理变化。网络毒理学方法辅助斑马鱼暴露实验研究的一致结果，表明27-BCZ可能抑制肝细胞PI3K-Akt信号通路介导细胞凋亡，进而导致肝脏损伤。本研究在一定程度上，明确了网络毒理学方法应用于环境有机污染物毒性机制预测的可靠性。为深入研究27-BCZ致肝脏毒性的分子机制奠定了基础，同时也为环境有机污染物毒性机制的研究提供了新的思路与方法。